鷹嘴豆愈傷組織誘導及培養條件的初步探索

摘要：為了研究鷹嘴豆愈傷組織誘導的培養條件，確定了種子消毒方法為75%乙醇處理3 min，5%次氯酸鈉溶液處理8 min，無菌水清洗后播種；鷹嘴豆萌發培養基為1/2MS；成苗培養基為1/2MS+0.5 mg/L IBA；外植體莖段長度為0.8 cm較為合適；2，4-D和6-BA激素濃度比例為1 ∶1時對愈傷組織形成有利，添加過多有抑制作用，誘導愈傷組織形成的培養基為B5+1 mg/L 2，4-D+2 mg/L 6-BA。

關鍵詞：鷹嘴豆；愈傷組織；培養條件；外植體莖段

中圖分類號： S529.043；Q943.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0063-03

收稿日期：2013-11-27

基金項目：國家自然科學基金（編號：31160306）；新疆農業大學校前期課題（編號：XJAU201202）；新疆農業大學大學生創新項目（編號：XJAU2014036）。

作者簡介：付國勇（1989—），男，甘肅武威人，碩士研究生，研究方向為生物技術。E-mail：fgyong1212@163.com。

通信作者：蘇豫梅，女，碩士，講師，研究方向為植物生物技術。 E-mail：suema1292005@163.com。鷹嘴豆（Cicer arietinum L.）是世界上栽培面積較大的食用豆類作物之一，主要分布在世界40多個國家，在我國主要種植于新疆、甘肅等省區[1]。鷹嘴豆是豆科鷹嘴豆屬植物，起源于亞洲西部和近東地區，全球栽培面積超過千萬公頃，大多分布在印度、巴基斯坦和土耳其等干旱或半干旱地區，是世界第三大豆科作物[2-4]。鷹嘴豆是我國維吾爾族人民喜愛的一種副食品，在新疆已有2 500年的歷史，種植面積在2萬hm2左右[5]。由于鷹嘴豆具有豐產耐旱、直立抗倒伏和較耐高溫的特點，因此十分適合在新疆等干旱和半干旱地區種植。就其產量而言，目前鷹嘴豆的實際產量小于 1 t/hm2，遠低于其5 t/hm2的理論產量，導致其產量過低的主要因素有干旱、低效落后的農業生產方式和病蟲害破壞。此外，鷹嘴豆作為一種大規模種植的豆科作物，其對于維持地球生物圈氮循環具有重要意義[6-7]。

目前，國內對鷹嘴豆的研究還處在起步階段，關于鷹嘴豆的遺傳轉化體系在國內還未見報道，新疆農業大學擁有地理和資源的優勢，有利于開展對鷹嘴豆遺傳轉化體系的研究工作。本研究以期為后續的鷹嘴豆轉基因、分子育種、離體組織培養等研究提供技術支持和理論依據，為鷹嘴豆經濟效益的提高和鷹嘴豆的高產提供一定的推動作用，對鷹嘴豆品種的改良和推廣具有積極的作用。

1材料與方法

1.1材料

供試鷹嘴豆種子為迪西型鷹嘴豆，由實驗室保存。

1.2種子消毒方法的選擇

選取成熟度好、大小均一的鷹嘴豆種子，分別以100粒種子為1份，進行3種消毒試驗，每組試驗重復3次。方法1：75%乙醇處理8 min后，無菌水清洗5～6次，無菌水浸泡 1 d，次日在超凈工作臺中，播種于1/2MS培養基中；方法2：75%乙醇處理3 min后，用5%次氯酸鈉溶液處理8 min，然后用無菌水清洗5～6次，無菌水浸泡1 d，次日于超凈工作臺中接種于1/2MS培養基中；方法3：0.1%氯化汞處理10 min，無菌水清洗5～6次，無菌水浸泡1 d，接種于1/2MS培養基中。用以上3種方法對鷹嘴豆種子進行消毒處理，過程均在超凈工作臺中完成。成苗基本培養基配方為1/2MS+30 g/L 蔗糖+Gelzan（一種植物凝膠） 2 g/L+1.97 g/L 氯化鎂+0.4 g/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。接種3 d后，統計污染率，計算公式為：

污染率=污染種子數/接種總數×100%。

1.3鷹嘴豆萌發培養基選擇

選擇最佳消毒方法對鷹嘴豆進行消毒后，于超凈工作臺中將其分別播種到MS、1/2MS、B5和1/2B5 4種不同的萌發培養基上，以無菌水作對照。每種培養基30瓶，每瓶接種3粒種子，于（26±2） ℃溫度、光照強度為2 000 lx、16-8 h光暗交替培養，接種7 d后觀察種子萌發及生長狀況。

1.4不同濃度IBA對成苗的影響

將IBA設置為5個濃度梯度（0、0.5、1、1.5、2 mg/L），分別加入到萌發培養基中，15 d后觀察其對鷹嘴豆成苗的影響，每個濃度梯度10瓶，每瓶播種3粒鷹嘴豆種子，于（26±2） ℃ 溫度、光照強度2 000 lx下16-8 h光暗交替培養，接種 15 d 后觀察種子萌發及生長狀況。

1.5外植體大小對愈傷組織形成的影響

采用鷹嘴豆的莖段為外植體，對其進行愈傷組織的誘導。將生長15 d的鷹嘴豆無菌苗分別切取成0.5、0.8、1.5 cm 3個長度的外植體，每種長度接種10瓶，每瓶接種6塊外植體。于（26±2） ℃溫度下，先暗培養2 d，再在光照強度為 2 000 lx、16-8 h光暗交替培養，接種25 d后觀察莖段的出愈情況及生長狀態。

1.6激素對愈傷組織形成的影響

將生長15 d的鷹嘴豆無菌苗切成相同大小的莖段，放置于以B5為基本培養基，添加不同濃度2，4-D和6-BA的誘導愈傷組織的培養基中，每個濃度接種10瓶，每瓶放置6塊莖段外植體，于（26±2） ℃溫度、光照強度2 000 lx、16-8 h光暗交替培養，接種25 d后觀察莖段的出愈情況及生長狀態。

2結果與分析

2.1不同消毒方法的選擇

分別用3種消毒方法處理后，將鷹嘴豆接種于1/2MS培養基中，觀察鷹嘴豆種子生長情況發現：用方法1消毒處理后的種子在3 d后大部分污染，無法利用其形成的鷹嘴豆苗；方法2消毒處理后的種子無污染，且長勢較好；方法3消毒處理后的鷹嘴豆種子在第3天開始出現褐變的現象，不久后死亡。通過對上述結果的觀察統計，可以確立鷹嘴豆種子的最佳消毒的方法是方法2，即75%乙醇處理3min，用5%次氯酸鈉溶液處理8 min，然后用無菌水清洗5～6次并浸泡1 d，次日于超凈工作臺中接種于成苗培養基中。不同消毒方法對鷹嘴豆出芽率的影響如圖1所示。

2.2鷹嘴豆種子萌發培養基的選擇

由圖2可知，5種不同的培養基都可使鷹嘴豆種子發芽，其中萌發率最高的是1/2MS。MS、B5、1/2B5 培養基中鷹嘴豆種子萌發率相差不大，但都不及1/2MS培養基，而鷹嘴豆種子在水中的萌發率最低。因此，使用1/2MS培養基作為鷹嘴豆種子萌發培養基。

2.3不同濃度IBA對成苗的影響

通過對添加不同濃度的IBA對鷹嘴豆成苗的結果進行對比后發現：0.5、1 mg/L的IBA對鷹嘴豆的成苗有促進作用，且鷹嘴豆幼苗長勢旺盛，相對不添加IBA的培養基成苗周期縮短2～3 d，以0.5 mg/L IBA效果最佳；而1.5 mg/L的IBA對鷹嘴豆的成苗有抑制作用，鷹嘴豆種子在該濃度的培養基上生長緩慢，成苗周期延長（圖3）。

2.4外植體大小對愈傷組織形成的影響

通過對接種不同大小的外植體對鷹嘴豆愈傷組織形成結果的觀察，發現0.5、0.8 cm的外植體在相同時間內都可形成愈傷組織，但是0.5 cm的莖段形成的愈傷組織過小，不利于后續試驗的進行；0.8 cm的莖段形成的愈傷組織大小合適，愈傷組織的狀態良好；1.5 cm的莖段形成的愈傷組織兩頭大中間小，且有栓質化的情況出現。從圖4可以看出，鷹嘴豆莖段形成愈傷組織的大小以0.8 cm左右較為適宜。

2.5激素對鷹嘴豆愈傷組織形成的影響

通過對不同激素組合的出愈結果的統計（表1），發現2，4-D對愈傷組織的形成有重要影響，6-BA對愈傷組織的形成效果不明顯，但是對愈傷組織的分化有一定作用。因此，誘導鷹嘴豆愈傷組織形成的最適培養基組合為B5+1 mg/L 2，4-D+1 mg/L 6-BA。

3結論與討論

3.1種子消毒劑的選擇

3.2硝酸銀對鷹嘴豆愈傷組織分化及誘導不定芽的影響

在鷹嘴豆不定芽的誘導試驗過程中發現，一定濃度的硝酸銀溶液對鷹嘴豆愈傷組織的分化有較好效果，但可能會導致愈傷組織出現畸形分化的現象，分析可能與銀離子的毒害作用有關，可以嘗試在繼代培養時采用隔代添加的方式來防止這種毒害作用，但添加適宜濃度的硝酸銀對不定芽的誘導有利[9]；由于不同激素濃度對愈傷組織分化有比較大的影響，也可能與培養基中2，4-D和6-BA濃度不合適有關。

3.3防止外植體褐化的方法

植物離體培養所面臨的一個主要的問題是外植體褐化，外植體的褐化受多種因素影響。目前認為造成外植體褐化的原因主要有2個方面，分別是生物體內的多酚氧化酶的氧化作用引起的褐變和非酶促的褐變[10]。植物組織離體培養過程中使用防止外植體褐化的添加物種類繁多，為減少外植體的褐化和壞死，通常需要在培養基中加入適當濃度的抗氧化劑如二硫蘇糖醇（DTT）、PVP、L-半胱氨酸、維生素C、活性炭、2-（N-嗎啉代）乙磺酸（MES）等，但是效果有較大的差異，且存在物種的差異[11-12]。在繼代過程中也可通過添加活性炭來防止愈傷組織的褐化，活性炭是一種較強的吸附劑，它可以吸附培養物分泌到培養基中的酚、醌等有害物質，從而有效減輕褐變。需要注意的是，活性炭在吸附有害物質的同時也吸附培養基中的生長調節物質，而使其失去作用，影響外植體的正常發育。因此，在加入活性炭的培養基中應適當改變激素配比，使得在防止褐變的同時，外植體能夠正常的發育。本研究發現，在培養基中添加抗氧化劑PVP可以有效抑制鷹嘴豆外植體的褐變。

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