鵝副黏病毒F基因的克隆和序列分析

摘要：為了深入研究鵝副黏病毒（goose paramyxovirus，GPMV）F基因的功能，利用PCR方法克隆了鵝副黏病毒HN株的F基因，將其與pMD18-T載體連接后轉化到感受態大腸桿菌DH5α中，經PCR鑒定后，對插入片段進行序列測定及分析。結果表明：鵝副黏病毒HN株的F基因全長均為1 662 bp，編碼553個氨基酸，其裂解位點的氨基酸序列為112-Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe-117，與已公布的強毒株裂解位點的氨基酸序列相符。

關鍵詞：鵝副黏病毒；F基因；克??；序列分析

中圖分類號： Q785；S858.335.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0035-02

收稿日期：2013-09-27

作者簡介：吳民（1964—），男，海南海口人，獸醫師，主要從事畜牧獸醫學方面研究。E-mail：WM8398@163.com。鵝副黏病毒（goose paramyxovirus，GPMV）是影響養禽業發展的主要病原之一，它可引起鵝腸道糠麩樣潰瘍、胰腺腫脹且表面有灰白色壞死灶、脾臟腫大并有大小不等的灰白色壞死灶。近年來，該病在我國呈上升趨勢，且感染宿主范圍不斷擴大，已有鵝、丹頂鶴、鴿等感染該病毒的報道[1-3]。本研究對以前分離的GPMV的F基因進行克隆，并與國內外分離株進行序列比對和分析，以期為進一步研究該病毒的F基因功能和GPMV分子診斷以及基因工程疫苗奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

從疑似感染GPMV的病死鵝中分離到鵝副黏病毒HN株，經過凍干后，于海南省動物疫病預防控制中心獸醫診斷檢驗科-70 ℃凍存。

1.2病毒增殖

將病毒適當稀釋后，經尿囊腔接種9～11 d非免疫雞胚，0.2 mL/枚，于37 ℃恒溫箱孵育48 h，棄去24 h內死亡胚，無菌收獲尿囊液，于-70 ℃保存備用。

1.3引物設計與合成

根據GenBank中的GPMV全基因組核苷酸序列，經 Lasergene 7.10軟件比對和Primer 5.0軟件分析后，設計1對引物擴增F基因，上游P1：5′-TAGTTCGCCTGTCTATCAAA-3′，下游P2：5′-GTGATGCGGTAGAACGGAT3-3′；由上海英濰捷基生物技術有限公司合成。

1.4RT-PCR反應

將含有GPMV的尿囊液按照Invitrogen公司提供的RNA抽提操作說明書進行RNA模板的提取。反轉錄按照寶生物工程（大連）有限公司提供的Reverse Transcriptase XL（AMV）反轉錄酶使用說明書進行。PCR反應體系為：2 μL模板，各50 pmol上、下游引物，各200 μmol/L 4種dNTP，0.5 μL Ex Taq DNA聚合酶，加水至50 μL。PCR反應條件為：97 ℃ 0.5 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環；72 ℃延伸 7 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.5F基因的克隆及鑒定

將新擴增PCR產物按一定比例與pMD18-T載體連接，連接產物轉化入DH5α感受態細胞，陽性菌液經PCR鑒定后擴大培養并抽提質粒，重組質粒置于-40 ℃冰箱保存備用。

1.6序列分析

將鑒定的陽性重組質粒，送上海英濰捷基生物技術有限公司進行測序。用Lasergene 7.10軟件將所測序列和與國內外病毒分離株的F基因序列進行相似性比對。

2結果與分析

2.1PCR擴增產物

利用設計的P1/P2引物對GPMV HN株的F基因進行RT-PCR擴增，結果獲得大小約為2.1 kb的特異性條帶，與預計產物大小相符（圖1）。

2.2重組質粒的鑒定

菌液PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得大小約為2.1 kb的片段。

2.3序列分析

由序列測定結果可知，GPMV HN株的F基因全長為 1 662 bp，編碼553個氨基酸。將GPMV HN株的F基因與國內外分離株的F基因序列進行比對，結果表明：GPMV HN株和國內已分離的GPMV的F蛋白核苷酸序列相似性在963%～97.3%之間，與傳統疫苗株LaSota的核苷酸序列相似性為82.7%，與國外分離株的F蛋白核苷酸序列相似性在34.8%～38.7%之間（表1）；從F基因進化樹來看，GPMV HN株與國內分離株處于同一分支，而與國外分離株處于不同分支（圖2）。

3結論與討論

GPMV HN株的分離鑒定再次證明水禽不再僅是禽Ⅰ型副黏病毒的宿主，而且已成為禽Ⅰ型副黏病毒自然感染發病、死亡的易感禽類。這可能與禽Ⅰ型副黏病毒發生變異、逐漸適應鵝體有關[4]。宿主范圍的不斷擴大，給禽Ⅰ型副黏病毒的綜合防控提出了新的挑戰。

國內外研究表明，禽Ⅰ型副黏病毒F蛋白的變異主要發生于F蛋白N末端信號肽區（1～32aa）和裂解位點區（112～117aa），其他部位的氨基酸較保守，且裂解位點區氨基酸的組成是構成副黏病毒毒力的分子基礎[5]。GPMV HN株的裂解位點區的氨基酸序列為112-Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe-117，與國外發表的強毒株序列112-Arg/Lys-Arg-Gln-Lys/Arg-Arg-Phe-117相符，表明所分離的GPMV HN株為強毒株。基因序列分析發現該分離株的F基因與GenBank登錄號為AF162714株系的F基因核苷酸相似性為97.1%，氨基酸相似性為97.7%，二者的相似性較高。進化樹分析表明兩者處于同一分支，具有較近的親緣關系，且同屬于強毒株。GPMV HN株與傳統疫苗株LaSota的核苷酸相似性為82.7%，氨基酸相似性為87.4%，二者的相似性較低，進化樹上雖屬于同一大分支，但親緣關系相對較遠，說明HN株與傳統的疫苗株LaSota相比已發生一定的變異，這可能是造成水禽長期使用傳統的新城疫病毒疫苗后仍暴發副黏病毒病的重要原因之一。

參考文獻：

[1]秦衛紅. 種鵝感染新城疫病毒的診斷[J]. 中國家禽，2012，34（23）：55.

[2]李靜姬，李福軍，梁玉嬉. 丹頂鶴非典型新城疫與大腸桿菌混合感染的診治[J]. 中國畜牧獸醫，2013，40（2）：211-213.

[3]趙揚，郭明萍，鄒年莉，等. 兩株鴿源新城疫病毒的分離鑒定及F基因序列分析[J]. 中國家禽，2012，34（23）：10-13.

[4]張偉，刁有祥，徐福亮，等. 鵝副黏病毒LS-1株的分離鑒定及F基因分析[J]. 西南大學學報：自然科學版，2011，33（4）：31-35.

[5]董國英，丁 壯. 鵝副黏病毒F基因的克隆及遺傳變異分析[J]. 中國獸醫學報，2007，27（2）：176-179.