海南省特有安諾蘭ISSR體系的優(yōu)化

摘要：以海南省特有安諾蘭為基因組材料，采用改進(jìn)的CTAB法提取安諾蘭葉片中的基因組DNA，通過單因素試驗，對ISSR-PCR反應(yīng)體系中各影響因子進(jìn)行優(yōu)化和篩選，建立適合海南安諾蘭的ISSR-PCR反應(yīng)體系：15 μL PCR反應(yīng)體積，10×PCR Buffer，200 μmol/L dNTPs，0.5 μmol/L引物，1.5 mmol/L Mg2+，1.0 U Taq DNA聚合酶，40 ng模板DNA。

關(guān)鍵詞：安諾蘭；ISSR-PCR；優(yōu)化

中圖分類號： Q949.718.43；S682.310.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0039-03

收稿日期：2013-10-17

基金項目：海南省自然科學(xué)基金（編號：310062）。

作者簡介：任軍方（1980—），女，河北石家莊人，助理研究員，研究方向為熱帶花卉種質(zhì)資源學(xué)。E-mail：renjunfang808@163.com。

通信作者：云勇，副研究員，研究方向為熱帶作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用。E-mail：yyong-3027@163.com。安諾蘭[Anota hainanensis （Rolfe）Schltr]為蘭科安諾蘭屬植物，海南省特有種，產(chǎn)于海南省中南部低海拔丘陵地區(qū)，熱帶附生蘭，附生于低海拔丘陵地區(qū)的楓樹上。安諾蘭在春節(jié)前后開花，花朵清麗、密集而芳香，是極好的新春賀歲花卉。

ISSR（inter simple sequence repeat）標(biāo)記即簡單重復(fù)序列區(qū)間DNA標(biāo)記，是由Zietkiewicz等于1994年提出的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)[1]，它利用基于SSR而設(shè)計的寡核苷酸引物來檢測2個SSR之間的一段短DNA序列差異。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是所需DNA量少、多態(tài)性好、無須預(yù)知研究對象基因組序列等[2]，因此該技術(shù)已被廣泛用于品種鑒定[3]、基因定位及遺傳多樣性分析[4-5]。由于ISSR技術(shù)也是基于PCR的一種分子標(biāo)記技術(shù)，所以它同其他分子標(biāo)記技術(shù)一樣，結(jié)果容易受多種因素干擾，如模板DNA濃度、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物濃度等都能影響擴(kuò)增結(jié)果，甚至其中一個因素改變都會影響擴(kuò)增條帶的位置或使其消失，從而影響整個試驗結(jié)果，因此在研究時應(yīng)先建立合適的反應(yīng)體系并對其進(jìn)行優(yōu)化[6-10]。本研究對海南省特有安諾蘭ISSR反應(yīng)體系進(jìn)行探索，旨在建立適于安諾蘭的ISSR反應(yīng)體系。

1材料與方法

1.1材料

供試安諾蘭來自于海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園林花卉研究所蘭圃，試驗地點(diǎn)在海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園林花卉研究所實驗室。

1.2試劑

Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA marker等試劑均購于上海生工生物工程有限公司。100條ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）提供的序列，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3試驗方法

1.3.1采用改良CTAB法提取DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，以DL 2000為標(biāo)準(zhǔn)，檢查所得DNA的分子量、含量、純度、完整性，并將DNA濃度稀釋至40 ng/μL。

1.3.2ISSR-PCR正交試驗設(shè)計采用正交試驗建立 ISSR-PCR 反應(yīng)體系并進(jìn)行優(yōu)化，參照陶興林等的方法[11-15]設(shè)置各個因素，考察模板DNA濃度、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物濃度等4個因素對ISSR反應(yīng)體系的影響，設(shè)定5個水平，建立U20（54）均勻設(shè)計表（表1、表2），確立海南安諾蘭 ISSR-PCR 反應(yīng)體系，每個處理重復(fù)2次。

3結(jié)論與討論

ISSR技術(shù)已被廣泛用于植物種質(zhì)資源鑒定、植物遺傳多樣性等研究。ISSR擴(kuò)增以PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)，因此影響PCR擴(kuò)增的因素如引物濃度、dNTPs濃度、模板濃度等都會對ISSR擴(kuò)增產(chǎn)生影響。植物種類、試驗條件不同，各因子間相互影響產(chǎn)生的擴(kuò)增結(jié)果也不相同，本研究中不同處理下的擴(kuò)增條帶存在差異，因此須要對這些因子進(jìn)行優(yōu)化，選擇最佳組合。DNA Taq酶濃度是影響試驗結(jié)果的重要因素，其濃度過高容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；濃度過低時，擴(kuò)增產(chǎn)物效率下降。dNTPs濃度太高容易引起錯配，濃度過低會影響擴(kuò)增效率。引物濃度則會影響擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量，濃度偏高會產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，濃度太低則無法進(jìn)行有效擴(kuò)增。另外，退火溫度、循環(huán)次數(shù)等也是反應(yīng)體系建立和優(yōu)化的重要因素[16-17]。

本研究采用單因素與正交試驗相結(jié)合的方法，對PCR各單因子進(jìn)行研究，建立了適合海南安諾蘭的ISSR反應(yīng)體系，即：總體積15 μL，10×PCR Buffer（含Mg2+）2.0 μL，200 μmol/L dNTPs，0.5 μmol/L引物，1.0 U Taq DNA聚合酶，模板DNA 40 ng，其他為超純水。并用ISSR引物823檢驗了該體系的穩(wěn)定性和可靠性，為海南安諾蘭的種質(zhì)資源分析奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20（2）：176-183.

[2]Shen J，Ding X Y，Liu D Y，et al. Intersimple sequence repeats（ISSR） molecular fingerprinting markers for authenticating populations of Dendrobium officinale Kimura et Migo[J]. Biological Pharmaceutical Bulletin，2006，29（3）：420-422.

[3]譚祖猛，李云昌，胡瓊，等. 分子標(biāo)記在油菜雜種優(yōu)勢利用中的研究進(jìn)展[J]. 植物學(xué)通報，2008，25（2）：230-239.

[4]梁明山，曾宇，周翔，等. 遺傳標(biāo)記及其在作物品種鑒定中的應(yīng)用[J]. 植物學(xué)通報，2001，18（3）：257-265.

[5]晏慧君，付堅，李俊，等. 云南普通野生稻遺傳多樣性和親緣關(guān)系[J]. 植物學(xué)通報，2006，23（6）：670-676.

[6]宣樸，鄧婧，陳新，等. 苦瓜ISSR擴(kuò)增條件優(yōu)化的研究[J]. 核農(nóng)學(xué)報，2006，20（3）：215-217，168.

[7]王佳，梁國華，繆旻珉，等. 正交設(shè)計優(yōu)化黃瓜ISSR體系[J]. 分子植物育種，2006，4（3）：439-442.

[8]劉小溪，李枝林，賈文杰，等. 百合ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（1）：30-33.

[9]寧靜，黃建安，李娟，等. 茶樹ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，36（4）：414-417.

[10]李承卓，史艷財，鄒蓉，等. 平果金花茶ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（11）：17-20.

[11]陶興林，胡立敏，朱慧霞，等. 花椰菜的ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26（3）：27-31.

[12]王興龍，金則新，李鈞敏，等. 接骨草ISSR擴(kuò)增條件優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（4）：49-51.

[13]喬燕春，林順權(quán)，楊向暉，等. 均勻設(shè)計在枇杷ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化中的應(yīng)用[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28（1）：123-126.

[14]王方，袁慶華. 冰草ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 草地學(xué)報，2009，17（3）：354-357.

[15]馬嘯. 老芒麥野生種質(zhì)資源的遺傳多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[16]白錦軍，魏安智，王佳，等. 仁用杏ISSR分析體系的正交優(yōu)化[J]. 分子植物育種，2009，7（6）：1237-1244.

[17]閆林，黃麗芳，譚樂和，等. 咖啡ISSR與RAPD-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化[J]. 熱帶作物學(xué)報，2012，33（5）：854-859.