川芎中阿魏酸類效應組分的提取純化工藝研究

摘要 [目的]優化川芎中阿魏酸類效應組分的提取純化工藝條件。[方法]以溶劑量、提取次數、乙醇濃度、提取時間為考察因素，以阿魏酸類組分為檢測指標，采用正交試驗優化川芎中阿魏酸類效應組分的提取工藝；以樹脂類型、上樣量、除雜溶劑、洗脫溶劑等為考察因素，以阿魏酸為測定指標，優化阿魏酸類組分的純化工藝。[結果]確定川芎中阿魏酸類組分優化的提取工藝為：料液比1 ∶8（g/ml），乙醇濃度70%，提取3次，每次0.5 h；阿魏酸類組分的純化樹脂為HP300大孔吸附樹脂，上樣量為5 ∶1（川芎：樹脂），2 BV水除雜，2 BV濃度50%乙醇洗脫，回收溶劑、真空干燥，純化物中阿魏酸和總酚酸的含量分別為9.71%和18.69%。[結論]所優化的提取純化條件為川芎效應組分的進一步研究開發奠定了理論基礎。

關鍵詞 川芎（RHIZOMA CHUANXIONG）；阿魏酸；正交試驗；大孔吸附樹脂

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）17-05410-03

Abstract [Objective] To optimize the extraction and purification of ferulic acid ingredients from Chuanxiong Rhizoma. [Method] The effects of solidliquid ratio， extract times， ethanol concentration and extract time were investigated to obtain the extraction technology of the ferulic acid ingredients from Chuanxiong Rhizoma according to the orthogonal test. The purification of the resins for ethanol extracts investigated the resin type， sample amount， cleaning solvent and elution solvent. [Result] The optimal technical conditions were extracted twice with 70% ethanol on the ratio of 1 g ∶ 8 ml for ferulic acid ingredients when treatment time was 30 minutes. The organic acid of Chuanxiong Rhizoma with HPD300 macroporous resin was absorbed effectively.

The proportion of the crude drug and drying macroporous resin was 5 ∶1. The extract was added to the column of macroporous resin， then washed with distilled water and 50% alcohol， respectively. The 50% alcohol eluent was collected， in which the content of ferulic acid and total phenolic acid was 9.71% and 18.69 % in solids， respectively. [Conclusion] The study explores a practical extraction method for ferulic acid ingredients from Chuanxiong Rhizoma and lays a good foundation for its further research.

Key words Chuanxiong Rhizoma； Ferulic acid； Orthogonal test； Macroporous resin

中藥川芎（RHIZOMA CHUANXIONG）為傘形科藁本屬植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖，始載于《神農本草經》，具有活血行氣祛風止痛的功效，主要用于血瘀氣滯所致的月經不調，痛經閉經，肝郁氣滯而致血行不暢的胸肋疼痛，頭痛，風寒濕痹，跌打腫痛等疾病[1]。川芎中主要活性成分為揮發油、酚酸類的阿魏酸、苯酞類成分[2-5]。藥理學研究表明，阿魏酸具有抑制血小板聚集、抑制5-羥色胺從血小板中釋放、阻止靜脈旁路血栓形成、抗動脈粥樣硬化、清除自由基、增強免疫功能等多方面的藥理活性[6-9]。因此，川芎總酚酸類尤其是阿魏酸成分是其重要活性成分，篩選川芎中的總酚酸、阿魏酸的提取純化工藝具有一定的藥用價值和實際意義。筆者采用多種大孔吸附樹脂篩選出川芎中阿魏酸及總酚酸的提取純化工藝條件，以期為川芎的開發應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。川芎飲片，購自中國中醫科學院廣安門醫院藥房，標示為北京豐泰金源藥業有限公司（批號12091002，產地四川），經張翠英副研究員鑒定為傘形科植物川芎的干燥根莖加工成的飲片。

1.1.2 主要儀器。Agilent 1200型高效液相色譜儀，配置四元梯度泵、在線脫氣機、DAD檢測器，購自安捷倫公司；METTLER AB135-S電子天平，購自瑞士；HZS4水浴振蕩器，購自哈爾濱市東聯電子科技開發有限公司；B600B型臺式低速離心機，購自北京白洋醫用離心機有限責任公司；超純水系統，購自USA Millipore公司。

1.1.3 主要試劑。阿魏酸對照品（批號1107739910），購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈（色譜純），購自美國FISHER公司；甲醇和冰醋酸（分析純），購自北京化工廠；乙醇（醫用乙醇），購自北京鴻志偉達工貿有限公司；大孔吸附樹脂HPD100、HPD300、HPD400、HPD400A、HPD450、HPD500、HPD600、HPD700、D101、AB-8和DM130，均購自河北滄州寶恩吸附材料科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 阿魏酸對照品貯備溶液的制備。精密稱取阿魏酸對照品適量分別置10 ml棕色量瓶中，加無水乙醇配制成阿魏酸對照品貯備溶液（0.218 mg/ml）。

1.2.2 含量測定。精密吸取提取液稀釋適當倍數，正交試驗中阿魏酸類組分的檢測采用紫外分光光度法測定，樹脂純化中阿魏酸的檢測采用HPLC法測定，根據標準曲線計算相應的含量。

1.2.3 川芎的提取溶媒單因素考察。稱取川芎粉末5.00 g，置于圓底燒瓶中，分別加入不同濃度的乙醇溶液（水、濃度20%乙醇、濃度40%乙醇、濃度60%乙醇、濃度80%乙醇和濃度95%乙醇）50 ml，稱重，加熱回流提取30 min，放置室溫，用相應的溶劑補足減失的重量，過濾后按上述紫外分光光度法測定阿魏酸類組分的含量。結果表明，40%～95%乙醇提取率較高，故選擇40%以上的乙醇作為提取溶劑。

1.2.4 川芎的L9（34）正交試驗。以對影響提取效果的主要因素加水量、提取次數、提取溫度、提取時間進行優選，考察指標為阿魏酸類效應組分的提取率，應用L9（34）正交表安排試驗，因素及水平安排見表1。稱取川芎粉末9份，每份5.00 g，提取、過濾，濾液合并，適當稀釋，采用紫外分光光度法測定阿魏酸類效應組分的含量。

1.2.5 大孔吸附樹脂的預處理。用2 BV（大孔吸附樹脂柱柱床體積）乙醇浸泡24 h以上，用乙醇沖洗，沖洗至無白色混濁物，流出液與水以1 ∶1的比例混合后仍澄清，再用水洗至無醇味。

1.2.6 靜態吸附篩選樹脂。稱取各型號大孔吸附樹脂5.00 g，置于錐形瓶中，分別加入已知阿魏酸含量的川芎提濃縮液100 ml，水浴恒溫（30 ℃）振搖（60 r/min）24 h；吸附后的溶液過濾，HPLC法測定阿魏酸，計算每種樹脂的吸附量。同時將每種吸附川芎提取液的大孔吸附樹脂分別用4 BV的水、6 BV的濃度50%乙醇、4 BV的濃度70%乙醇依次洗脫，采用HPLC法測定洗脫液中阿魏酸的含量，計算每種樹脂的比吸附量、比洗脫量。

1.2.7 大孔吸附樹脂的動態吸附。分別稱取預處理好的HPD300和HPD600大孔吸附樹脂適量，裝入玻璃層析柱（內徑1.5 cm），精密吸取川芎水提濃縮液上樣，以4 BV/h上樣，每10 ml流出液取樣一次，HPLC法測定阿魏酸的含量，根據流出液體積和阿魏酸的滲出量繪制吸附曲線。

1.2.8 除雜溶劑的篩選。取HPD300大孔吸附樹脂5.00 g，加川芎提取液90 ml，上柱流速為4 BV/h，分別用水與5%乙醇除雜，每1 BV流出液取樣一次，HPLC法測定阿魏酸的含量。

1.2.9 洗脫溶劑的篩選和洗脫體積的確定。HPD300大孔吸附樹脂各5.000 g裝入3根層析柱，精密吸取川芎水提濃縮液上樣，先用2 BV水除雜，再分別用濃度15%乙醇、濃度30%乙醇、濃度50%乙醇洗脫，每1 BV洗脫液收集一次，HPLC法測定洗脫液中阿魏酸的含量，根據流出液體積和阿魏酸的洗脫量繪制洗脫曲線。

1.2.10 工藝驗證試驗。取川芎粉碎藥材，濃度70%乙醇，料液比1 ∶8（g/ml），提取3次，每次提取時間為0.5 h，提取液合并，濃縮至3.6 ml/g；水提濃縮液用HPD300大孔樹脂純化，上樣后用2 BV水除雜，再用2 BV的濃度50%乙醇洗脫，洗脫液濃縮干燥得川芎純化物。

2 結果與分析

2.1 紫外分光光度法測定阿魏酸類效應組分 精密吸取阿魏酸貯備溶液適量分別配制成一系列濃度的對照品溶液，在最大吸收波長311 nm下測定吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標，濃度（X，μg/ml）為橫坐標進行線性回歸。結果表明，阿魏酸在2.18～21.80 μg/ml濃度范圍內與吸光度的線性關系良好，標準方程為Y=91.98 8X-0.007 1（R=0.999 9）。

2.2 HPLC法測定阿魏酸 精密稱取阿魏酸對照品適量置10 ml棕色量瓶中，加濃度75%甲醇配制成阿魏酸對照品貯備溶液（0.218 mg/ml）；精密吸取貯備溶液適量分別配制成一系列濃度的對照品溶液（2.18、4.36、8.72、13.08、17.44、21.8、218 μg/ml）；Agilent TCC18 BDS（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相為無水甲醇-濃度0.5%醋酸（35 ∶65，V/V）；流速為1.0 ml/min；檢測波長321 nm；柱溫為30 ℃，進樣量5 μl，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標進行線性回歸。結果表明：阿魏酸在2.18～218.00 μg/ml濃度范圍內與吸光度的線性關系良好，其回歸方程為Y=21 182.9X-39.301 8（R=0.999 9）。其中對照品和樣品的HPLC色譜圖見圖1。

2.3 正交試驗的結果分析 根據正交試驗結果（表2）和方差分析結果可知，因素C（乙醇濃度）和D（提取次數）對提取效果影響顯著（P<0.05），因素A（溶劑用量）也有影響，而因素B（提取時間）的影響非常小，可忽略不計，故作為誤差項。考慮最少的溶劑用量和最短的提取時間，減少濃縮的麻煩，最終確定其最佳提取條件為A2B1C2D3，即料液比1 ∶8（g/ml），乙醇濃度70%，提取3次，每次0.5 h。經過3批驗證試驗，結果表明該工藝穩定可行。

2.4 靜態吸附篩選的結果 根據每種樹脂的吸附量、比吸附量、比洗脫量（表3），其中HPD300、HPD500、HPD600、HPD100、AB-8型號大孔吸附樹脂的比吸附量比較高，同時結合樹脂的解吸附情況，HPD300和HPD600樹脂的比解吸附量明顯好于其他樹脂，所以初步選擇此2種樹脂進行動態情況考察篩選樹脂。

2.5 大孔吸附樹脂的動態吸附和洗脫情況優選樹脂 根據流出液體積和阿魏酸的滲出量繪制的吸附曲線（圖2）可以看出，HPD300大孔吸附樹脂的上樣量大于90 ml時，開始有少量阿魏酸滲漏；而HPD600大孔吸附樹脂的上樣量在40 ml時，開始有阿魏酸滲漏，故HPD300大孔吸附樹脂的動態吸附性能好于HPD600，因此選擇HPD300大孔吸附樹脂作為川芎的吸附純化樹脂，且上樣量為90 ml。

2.6 除雜溶劑的篩選 用2 BV水除雜，HPLC圖譜顯示雜質已基本除盡，阿魏酸的洗脫量為0.29 mg；而2 BV濃度5%乙醇除雜，阿魏酸的洗脫量為0.42 mg，乙醇濃度增加阿魏酸的滲漏增加，故選用2 BV水除雜。

2.7 洗脫溶劑的篩選和洗脫體積的確定 根據流出液體積和阿魏酸的洗脫量繪制洗脫曲線（圖3）可知，濃度50%乙醇的洗脫效果優于濃度30%乙醇和濃度15%乙醇，且2 BV的濃度50%乙醇能基本完全洗脫阿魏酸，故選用濃度50%乙醇2 BV進行洗脫即可。

2.8 提取純化工藝驗證試驗 計算得川芎純化物的出膏率為0.5%，純化物中阿魏酸和總酚酸的含量分別為9.71%和18.69%，表明通過樹脂純化的方法可以獲得純度較高的川芎阿魏酸類效應組分。

3 結論與討論

樹脂純化分離是一種動態過程，動態過程是以孔徑影響為主，所以動態結論更加可靠。靜態吸附是以比表面積為主要影響因素，但靜態吸附對于大范圍縮小樹脂范圍有較大的優勢。在篩選樹脂的實際過程中，需要動態吸附和靜態吸附相結合，首先采用靜態吸附更快捷地大范圍初篩樹脂類型，然后以動態吸附法優化吸附量、洗脫溶劑、洗脫流速、pH值等各方面的參數，進而確定最合適的大孔吸附樹脂。

洗脫試驗結果表明，盡管乙醇的濃度大于50%時，阿魏酸的洗脫量變化不大，但雜質增多，為了保證有效成分盡可能轉移且純化物中有效組分的含量，最后決定選用50%乙醇作為川芎的洗脫液。

川芎的化學成分包括揮發油、酚酸類、多糖類、生物堿等，而其主要有效成分阿魏酸的含量僅0.10%左右[10-11]，所以阿魏酸的富集、精制、純化存在一定的難度。使用大孔吸附樹脂富集純化阿魏酸，能大大提高純化后總固體物中阿魏酸含量（近100倍）。因此無論是從精制程度、解吸附方面，還是從結果分析來看，大孔吸附樹脂法適用于川芎中阿魏酸的純化。

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