黔產金櫻子變型的ISSR分析

摘要 [目的]揭示貴州境內不同變型金櫻子10個居群間的遺傳變異情況。[方法]采用ISSR分子標記技術，從ISSR隨機引物中，篩選有效引物，進行擴增，用NTSYSpc，ver.2.02軟件進行UPGMA聚類分析。[結果]10個居群不同變型金櫻子的相似性系數在0.09～0.35，聚成A、B 2大類。[結論]同一變型的金櫻子樣品并不嚴格為一類，不同變型金櫻子樣品之間的遺傳變異較大。

關鍵詞 金櫻子；ISSR；遺傳變異

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）17-05425-02

Abstract [Objective] The heritable variation of 10 was uncovered for different variants of Rosa laevigata Michx. in Guizhou. [Method] By using ISSR molecular marker technology， effective primers were screened from random primers， and were amplified by ISSR. UPGMA cluster analysis was conducted by NTSYSpc， ver.2.02. [Result] The similarity coefficients of the 10 populations were from 0.09 to 0.35， and divided into 2 groups for A and B. [Conclusion] Individuals of the same population did not strictly cluster together and the genetic diversity of individuals in different populations was considerably high.

Key words Rosa laevigata Michx.； ISSR； Heritable variation

金櫻子來源為薔薇科植物金櫻子（Rosa laevigata Michx.）的干燥成熟果實，具較高的藥用及食用價值，能補腎益氣、澀精縮尿、止瀉，用于遺精滑精和遺尿尿頻等。現代藥理研究表明，金櫻子可降低血清膽固醇含量，可使腸壁之粘膜收縮，分泌減少而有止瀉作用，并具明顯的抗菌及抗病毒作用。因其富含維生素C、糖等，亦可食用，開發應用前景十分廣闊，經濟效益潛力頗大。金櫻子在我國西南、華南、華中、華東均有分布，尤其以貴州分布最廣，產量最高，是貴州大宗藥材之一。為了探討貴州境內金櫻子的遺傳分化情況。筆者在DNA分子水平上，采用ISSR分子標記技術，對金櫻子已出現的不同變型即莖為綠色型的綠金櫻子、莖為紅色型的紅金櫻子、果刺為黑色型的黑金櫻子、果實瘦長型的瘦金櫻子、果實胖圓型的胖金櫻子的遺傳變異進行研究，以期為金櫻子的優良性評價和種質資源保護等提供參考[1]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。于2012年主要采集于貴州4個產地品種共10個居群，經貴陽醫學院生藥學教研室鑒定為金櫻子Rosa laevigata Michx.的不同變型（表1）。

1.1.2 主要儀器。BECKMAN，GS15R低溫高速離心機和紫外-可見光分光度計，購自上海分析儀器廠；GDS7600G凝膠成像儀和電泳儀，購自北京六一儀器廠。

1.1.3 主要試劑。Taq酶和PCR相關試劑，均購自上海生物工程有限公司；引物，由上海生物工程有限公司合成；其他生化類和有機試劑均由華美生物工程公司提供。

1.2 方法

1.2.1 金櫻子基因組DNA的提取。采用改良CTAB法[2]。提取DNA流程：①取樣品0.100 g，加少量石英砂，在研缽中磨碎，分裝于1.5 ml的離心管中；②加入0.6 m1 2×CTAB，在65 ℃的水浴鍋中保溫40 min；③12 000 r/min離心10 min，上清液轉入新管；④加入等體積氯仿-異戊醇（24 ∶1，V/V），緩慢搖動5 min；⑤室溫下10 000 r/min離心10 min；⑥上清液轉入新管中加2/3倍體積的異丙醇，混合后于-20 ℃冰箱靜置40 min；⑦室溫下10 000 r/min離心5 min；⑧沉淀用濃度70%乙醇洗2次，風干；⑨加1×TE溶解備用。1%瓊脂糖檢測DNA質量。

3 結論與討論

ISSR（Inter simple sequence repeats）標記是20世紀90年代中期發展起來的一種新型的分子標記技術[1]，其原理是根據真核生物基因組中廣泛存在的簡單重復序列，設計出各種能與SSR序列結合的PCR單一引物，對2個相距較近、方向相反的SSR序列之間的DNA區段進行擴增。擴增的指紋圖可以同時提供基因組內多個位點的序列信息。ISSR標記結合了SSR和RAPD的優點，具有模板需要量少，多態性豐富，無需試劑盒，結果記錄方便，試驗成本低，操作簡單，穩定性較高等優點，現已成功地用于許多栽培種和野生種的遺傳多樣性研究[3-5]。

試驗結果表明，10個居群金櫻子ISSR擴增結果的遺傳相似性系數在0.09～0.35，聚成A、B 2大類群，同一變型的金櫻子樣品并不嚴格聚為一類，不同變型金櫻子樣品之間的遺傳變異較大。黑金櫻子僅在A類中有分布；瘦金櫻子、胖金櫻子僅在B類中有分布。同一變型金櫻子沒有聚到一起，這可能與金櫻子變型的分類主要是以其外觀色澤、胖、瘦等性狀為依據有關。金櫻子、綠金櫻子、紅金櫻子在A、B 2類中均有分布，說明其變異程度較大。此外，在2個類群中混合分布了采自貴州境內不同產地的金櫻子種質，顯示金櫻子各變型間親緣關系與產地的相關性不大，說明貴州境內不同產地金櫻子有移栽的情況[5，7]。

試驗對金櫻子ISSR 反應體系和條件進行了優化，并對以貴州省為主分布的不同居群、不同變型綠莖、紅莖、黑刺、瘦長果、胖圓果金櫻子的遺傳變異情況進行了初步分析，對金櫻子品種指紋圖譜的構建，品質評價、種質資源保護等具有重要意義[8]。

參考文獻

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