玉米遺傳連鎖圖譜加密及粗縮病抗性QTL定位

摘要 [目的]加密玉米SSR遺傳連鎖圖譜，對玉米粗縮病抗性QTL進行精確定位分析。[方法]以（80007×80044）F9 ∶10為作圖群體，在實驗室前期建立的SSR遺傳圖譜基礎上，將檢測到的新的87個標記加密到遺傳圖譜中，最終構建包括260個位點的遺傳連鎖圖譜；同時將RIL群體衍生的195個F9 ∶10家系進行田間抗病性狀鑒定，采用完備區(qū)間作圖方法（ICIM）對玉米粗縮病抗性進行QTL的定位分析。[結果]圖譜總長度1 170 cm，標記間平均距離4.50 cm；在濟寧環(huán)境條件下定位到1個QTL，表型變異貢獻率為9.57%，可作進一步的精細定位和克隆。[結論]該試驗對玉米粗縮病抗性QTL進行了精確定位分析，為玉米SSR遺傳連鎖圖譜研究提供了依據。

關鍵詞 玉米；SSR；遺傳連鎖圖譜；粗縮病；數(shù)量性狀位點（QTL）

中圖分類號 S513 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）17-05348-04

Abstract [Objective] To increase density of maize SSR genetic linkage map， QTL for resistance to maize rough dwarf disease was identified. [Method] A mapping population consisting of 195 F9 ∶10 recombinant inbred lines（RILs） derived from the cross between maize inbred lines 80007 and 80044 was used in this study. Based on the genetic linkage map in our laboratory， 117 pairs of markers were screened polymorphism between the parents in 430 pairs of new SSR markers， and 87 pairs of these were used to increase density of genetic linkage map. The final map included 260 polymorphic SSR markers. [Result] The total genetic length was 1 170 cm with an average interval distance of 4.50 cm. One QTL for MRDD was identified in Jining environment， explaining 9.57% of the phenotypic variation， which could be used for fining mapping and positional cloning. [Conclusion] QTL for resistance to maize rough dwarf disease was identified and analyzed， which will provide basis for study on maize SSR genetic linkage map.

Key words Maize； SSR； Genetic linkage map； MRDD； Quantitative trait locus

玉米粗縮?。∕aize Rough Dwarf Disease，MRDD）是一種世界性的玉米病害，嚴重影響全球玉米生產。自1954年在我國新疆南部和甘肅西部等地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)玉米粗縮病以來，在我國各玉米產區(qū)陸續(xù)發(fā)生，現(xiàn)已蔓延至黃淮海、華北、西北和東北的大部分玉米產區(qū)。在我國，導致玉米粗縮病的主要病原是水稻黑條矮縮病毒（Rice Black Streaked Dwarf Viral，RBSDV）[1]，其主要傳毒媒介為灰飛虱[2-3]。近年來，隨著氣候環(huán)境的變化和種植結構的調整，全國（尤其是黃淮海地區(qū)）玉米粗縮病的發(fā)生呈明顯上升趨勢[4]。1996年河北省爆發(fā)玉米粗縮病，發(fā)病面積達75.6萬hm2，造成了大幅度減產和嚴重的經濟損失[5]。2008年江蘇省發(fā)生面積達15.7萬hm2，占江蘇玉米種植面積的40%[6]。自2005年以來山東省連續(xù)多年嚴重發(fā)生玉米粗縮病，其中2008年到2011年連續(xù)4年發(fā)病面積均高于80萬hm2，主要發(fā)生在臨沂、棗莊、泰安、濟寧等地區(qū)，發(fā)病較重的地塊病株率一般為20%～30%，個別地塊可達70%～80%，嚴重的地塊甚至絕收[7-8]。粗縮病已經成為我國主要玉米病害之一，對玉米生產構成嚴重威脅。目前，粗縮病的防治基本上采取農業(yè)防治為主，化學防治為輔的綜合防治策略。調整播期和化學防治等雖然在一定程度上能夠控制粗縮病的發(fā)生和傳播，但均不是理想的防治措施。培育抗病品種是防治玉米粗縮病最行之有效的方法，但常規(guī)育種方法培育抗病品種周期長，抗病性鑒定又受環(huán)境影響較大，大大增加了抗病育種的工作難度。利用玉米粗縮病抗性QTL進行分子標記輔助選擇，可以不受時間及環(huán)境的限制，能加速抗粗縮病玉米育種的工作進程，對于實現(xiàn)病害的持久防治具有重要意義。

近年來，國內外學者對玉米粗縮病抗性QTL定位的研究報道很多，利用不同群體檢測到多個抗性QTL，幾乎在玉米10條染色體上均有抗性QTL被檢測到[9-17]，這些研究對闡明玉米粗縮病的遺傳機制起到了一定作用。但由于不同研究所用的群體類型和大小、遺傳背景、遺傳圖譜密度及統(tǒng)計分析方法的不同，同一性狀定位的QTL存在著數(shù)目、位置及效應方面的差別，并且難以定位到在多種環(huán)境條件下均能穩(wěn)定表達、且效應較大的QTL，從而限制了研究結果在育種中的應用。如，史利玉等在2007年的研究中，玉米自交系黃早四作為抗病材料，但在2011年的鑒定結果卻為感病材料[10，13]，玉米材料抗病鑒定的不穩(wěn)定性對玉米粗縮病QTL定位分析造成嚴重影響。實驗室以（80007×80044）F5 ∶6為群體材料，構建了包含173個位點的遺傳連鎖圖譜，在泰安和肥城環(huán)境下共檢測到8個QTL，分別位于第1、2、5號染色體上。為進一步確定抗病材料的穩(wěn)定性，筆者以（80007×80044）F9 ∶10為群體材料，在前期研究的基礎上進一步加密玉米SSR遺傳連鎖圖譜，并對玉米粗縮病抗性QTL進行精確定位分析，以期為抗玉米粗縮病分子標記輔助選擇（MAS）育種及抗粗縮病基因的精細定位和克隆提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 構建群體的親本為玉米自交系80007和80044。2007年以抗玉米粗縮病的自交系80007為母本，感病自交系80044為父本配制雜交組合，以F2為基礎采用單粒傳種法，經過連續(xù)多代自交構建了RIL群體，作為性狀遺傳分析的供試群體。

1.2 田間試驗 將RIL群體及其親本于2013年分別種植在山東農業(yè)大學農學實驗站和山東省濟寧市農業(yè)科學院實驗站，每個家系種植25株。確定播期使玉米苗期的感病階段與灰飛虱成蟲的遷飛盛期相遇。2個環(huán)境下的群體材料均常規(guī)栽培管理，使其田間自然感病。

1.3 田間抗病性調查 在玉米成株期，參照路銀貴等[18]的方法分成1、3、5、7、9共5個等級對群體進行玉米粗縮病病情調查。在分級調查病情的基礎上，計算行發(fā)病率。行發(fā)病率（%）=∑（發(fā)病等級×該等級植株數(shù)）×100/（最高發(fā)病等級×總植株數(shù)）。

1.4 DNA提取及SSR標記分析 在玉米幼苗期，剪取RIL群體及其親本葉片，采用SDS法[19]提取基因組DNA。在玉米10條染色體上選取430對SSR引物進行親本間多態(tài)性篩選。公共引物序列均來自MaizeGDB（http：//www.maizegdb.org/），引物由上海生物工程公司（Sangon Company）合成。PCR反應總體積為15 μl，包含：10×buffer（+MgCl2） 1.5 μl；dNTP（2.5 mmol/L） 1.2 μl；Taq酶（0.3 μl）；Forward primer（10 μmol/L） 0.4 μl；Reverse primer（10 μmol/L） 0.4 μl；DNA（20～50 ng/μl）2.0 μl；ddH2O 9.2 μl。PCR擴增反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃復性40 s，72 ℃延伸50 s，35次循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增結束后，如長時間保存可放于-20 ℃。擴增產物加入適量溴酚藍（擴增產物和溴酚藍體積比為5 ∶1），混勻，在6%聚丙烯酰胺非變性凝膠上電泳，銀染顯色，然后用Tanon Gis2010型凝膠成像系統(tǒng)照相觀察。

1.5 數(shù)據記錄及分析 在Microsoft Excel上建立數(shù)據庫。對電泳帶型進行基因型記錄，來源于母本80007的帶型記為A，父本80044的帶型記為B，此外極少數(shù)雜合帶型記為H，缺失帶型記為-。用SPSS13.0軟件對QTL定位群體2個環(huán)境下的調查結果進行方差分析以及多態(tài)性標記的卡平方檢驗。根據SSR分析的結果，利用JoinMap Version 4.0（http：//joinmap.nl）作圖軟件，加密遺傳連鎖圖譜。應用完備區(qū)間作圖（ICIM）軟件winQTLCart對表型值進行QTL定位分析，LOD閾值設定為2.5，如果LOD值大于2.5則說明該LOD值對應一個抗玉米粗縮病的QTL，以1 cm為步進區(qū)間，進行1 000次置換檢測。定位到的QTL位點，按照McCouch[20]等提出的規(guī)則進行命名，即q+性狀名稱縮寫+染色體上序號。

2 結果與分析

2.1 玉米RIL群體對粗縮病的抗性表現(xiàn) 用玉米粗縮病的行發(fā)病率表示發(fā)病情況，參照路銀貴[18]等提出的等級標準，對2個環(huán)境下自然發(fā)病的群體進行調查，根據田間調查結果將濟寧環(huán)境下F9 ∶10株系劃分等級（圖1），而泰安環(huán)境下群體發(fā)病較輕，通過對調查數(shù)據的分析沒能在泰安檢測出抗病QTL。圖1表明，RIL群體的行發(fā)病率范圍變化幅度比較大，在30%～100%范圍內呈連續(xù)性分布，整體趨向于感病親本。

2.2 分子標記的檢測與SSR遺傳連鎖圖譜的加密 在實驗室以前篩選的812對SSR引物的基礎上，增加了430對SSR引物，共1 242對引物在親本間進行多態(tài)性檢測，結果共篩選出316對多態(tài)性引物，多態(tài)性比例為25.44%。在新增加的430對引物中挑選了96對擴增條帶清晰、親本間條帶差異明顯的多態(tài)性引物進行分析。前期試驗構建的遺傳連鎖圖譜包含173個位點，在此基礎上試驗加密了87個位點最終構建了包含260個位點的遺傳連鎖圖譜，覆蓋玉米基因組1 170.00 cm，標記間平均距離4.50 cm，標記間最小遺傳距離為0.039 cm，每個連鎖群上的標記數(shù)為17～40個，標記在染色體上的順序與MaizeGDB（http：//www.maizegdb.org/）的基本一致（表1和圖2）。

2.3 玉米粗縮病抗性QTL檢測 試驗利用完備區(qū)間作圖法（ICIM）對濟寧環(huán)境下的粗縮病抗性QTL進行定位分析，定位結果表明，在濟寧環(huán)境下檢測到1個QTL，位于2號染色體上，LOD值為4.48，解釋了9.57%的表型變異，其加性效應為0.17，來自于抗病親本80007，與實驗室以前定位到2號染色體上的QTLs結果相同，但沒有檢測出商偉定位到第1和5號染色體上的抗性QTLs（圖2）。

3 結論與討論

3.1 群體類型的選擇及表型鑒定問題 目前常用的遺傳作圖群體有BC 群體、 F2群體、DH 群體、RIL 群體、NIL 群體等。作圖群體的選擇主要取決于所使用標記的類型，試驗使用的SSR 標記具有較高的多態(tài)性，可用于在親緣關系較近的親本甚至一些近交獲得的群體中構建遺傳圖譜[21]。RIL群體是將 F2個體連續(xù)自交或同胞交配、或群體內隨機交配，使得雜種的基因得以分離并進行重組，直至家系內個體基因型純合穩(wěn)定、家系間基因型各異，此時這些家系就構成了重組自交系群體。RIL群體作為固定的永久性群體，可以進行多年多點的重復試驗，是研究 QTL作圖、基因與環(huán)境互作的理想材料[22]。玉米粗縮病的田間自然發(fā)病條件難以控制，人工接種也不能確保發(fā)病的穩(wěn)定性，這為田間表型鑒定工作帶來很大的困難，利用永久性的RIL群體進行表型鑒定能夠準確判斷家系的抗性，提高定位的準確性。

3.3 玉米粗縮病的抗性遺傳研究 玉米自交系間抗病性差異顯著，不同自交系抗病配合力也存在顯著差異。王安樂[23]等認為玉米粗縮病抗性為數(shù)量性狀，多基因加性效應在性狀表達中起主導作用。盡管自交系的基因趨于純合，但玉米抗粗縮病基因仍可處于雜合狀態(tài)，只是雜合程度不同而 已。隨著定向輪回選擇，個體中微效抗病基因量值逐步增多，基因的累加效應也就增大，抗性也就隨之增強。王飛[24]對自交系90110、掖478及其F2群體、BC1群體進行玉米粗縮病抗病性鑒定，最終找到了4個與玉米粗縮病抗病基因連鎖的分子標記：umcl656（bin6.02）、umc1401（bin7.02）、bulg1823（bin8.07）和umcl268（bin8.07），推測在90110中至少存在3個玉米粗縮病抗病位點。陳永坤[9]以（黃早四×掖107）F8群體的179個家系為作圖群體，構建連鎖圖譜，在山西臨汾環(huán)境下進行抗病性鑒定及QTL定位分析，在染色體bin1.07、bin3.06和bin6.01區(qū)段檢測到3個QTL。同年，史利玉[13]等在山西臨汾和河北保定環(huán)境下對（黃早四×掖107）RIL群體進行抗病鑒定，結果共檢測到4個抗病QTL，分別位于第1、2、5、9染色體上。陳永坤和史利玉在利用同一RIL群體且代數(shù)相同的情況下，檢測到的QTL卻不完全相同，可能與鑒定環(huán)境有關：陳永坤的鑒定結果是在2005年山西臨汾1個環(huán)境下得到的；史利玉的結果是綜合了山西臨汾和河北保定2地3個環(huán)境下（2005臨汾、2006臨汾及2006保定）得到的結果。張彥軍[16]等以一對近等基因系構建的分離群體（NT409/NT411）F1為材料，在泰安5月份環(huán)境下檢測到的QTL位于標記phi21～umc1817；在泰安6月份環(huán)境下檢測到的QTL位于標記M6～M24。同一群體，在同一地點、不同時間檢測到的粗縮病抗性QTL不同。由于張彥軍采用的是田間自然感病的方法鑒定粗縮病，泰安5月份種植的群體苗期和泰安6月份種植的群體苗期分別與灰飛虱遷飛高峰期的重疊時間可能不同，導致鑒定結果有差異，檢測到不同的QTL。實驗室前期[15]以（80007/80044）F5 ∶6為群體材料，在泰安和肥城環(huán)境下共檢測到8個QTL，分別位于第1、2、5號染色體，且泰安和肥城環(huán)境下檢測到的第2號染色體上的QTL均與標記mmc0111連鎖。試驗以（80007/80044）F9 ∶10的RIL群體為材料，在第1、5號染色體上均未檢測到QTL，但在濟寧環(huán)境下檢測到的位于第2號染色體的QTL也與標記mmc0111連鎖，可能是同一個QTL。試驗結果與前期結果存在差異可能是以下幾方面的原因：①遺傳連鎖圖譜的加密，試驗結果更加準確。試驗構建的遺傳連鎖圖譜較商偉的圖譜在第1、5號染色體上分別增加了5、6個SSR標記，在圖譜加密的情況下反而沒有檢測到QTL，因此推測第1、5號染色體上可能不存在粗縮病抗性QTL。②2群體代數(shù)的不同，前期試驗的F5 ∶6群體雜合個體較多（理論上6.25%），試驗的F9 ∶10群體基因型相對比較純合（雜合基因型理論上為0.0039%），群體材料的抗病位點也更加純合，定位結果應該更加準確。③鑒定環(huán)境的不同，前期的定位結果是在泰安和肥城環(huán)境下得到的，該試驗結果是在濟寧環(huán)境下得到的，不同地點粗縮病發(fā)病情況不同，鑒定結果也不同。

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