抗浪魚MC4R基因的PCR擴增及序列分析

摘要 [目的]對抗浪魚MC4R基因進行PCR擴增。[方法]采用PCR方法，依據鯽魚的黑素促黑素受體4（MC4R）基因保守區的核苷酸序列，采用引物設計軟件，對抗浪魚的MC4R基因設計出一對引物進行PCR擴增和純化測序，并利用phylip軟件對抗浪魚和其他已知MC4R基因序列的魚類構建基因進化樹。[結果]抗浪魚MC4R基因的擴增長度為1 001 bp。9種魚類的MC4R核苷酸序列聚為2大類。其中，比目魚單獨聚為一類；斑劍尾魚、舌齒鱸、白斑角鯊、斑馬魚、抗浪魚、黑青斑河豚、中華多紀豚和紅旗東方豚聚為一類。[結論]抗浪魚與斑馬魚的親緣關系最近，與比目魚的親緣關系最遠。

關鍵詞 抗浪魚；MC4R基因；多聚酶鏈反應；進化樹

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）17-05385-02

Abstract [Objective] MC4R gene from Schizothorax taliensis was amplified by PCR method. [Method] The primers were designed by the conservative MC4R of Crucian carp gene sequence. After the purification and sequencing， polygenetic tree for MC4R gene of Schizothorax taliensis and other fish species was constructed using phylip software. [Result] The MC4R gene of Schizothorax taliensis is 1 001 bp in length. MC4R nucleotide sequences of 9 fish species were clustered into 2 categories. Paralichthys olivaceus clustered into a separate category， Poeciliidae， Dicentrarchus labrax， Squalus acanthias， zebra fish， Schizothorax taliensis， black spot puffer， black spot puffer and red fugu belonged to another category. [Conclusion] The closest relative is zebra fish and the relationship of the farthest grouper is Paralichthys olivaceus.

Key words Schizothorax taliensis； MC4R gene； PCR； Polygenetic tree

抗浪魚，原名鱇魚浪白魚（Anabrilius grahami），屬鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）鮊亞科（Cultrinae）白魚屬（Anabarilius），是云南特有的4大土著名魚之一。抗浪魚僅分布于我國的撫仙湖，歷史上產量曾占撫仙湖總漁產量的70%～80%，足見其在漁業中的重要地位，是產地重點保護和發展的主要對象[1]。

黑素促黑素受體-4（MC4R）屬于黑素促黑素家族的一員。MC4R具有介導瘦素（leptin）蛋白的功能，是一個調節能量平衡與能量動態平衡的重要信號分子[2]，具有控制動物食欲、體重和能量代謝等作用[3]。1997年，Huszar等對敲除MC4R基因的小鼠進行了研究[4]，發現敲除MC4R基因的小鼠出現遺傳性肥胖，表現出多食、胰島素分泌過多以及肥胖等癥狀。MC4R可與腦部分泌的天然內原配體α促黑激素（alpha melanocyte stimulating hormone ，αMSH）結合，抑制攝食，導致血糖降低、低胰島素和瘦素水平，從而減少體脂，降低體重，是一個調節動態平衡的重要信號分子[5-6]。近年來，MC4R基因在介導肥胖癥中發揮的作用越來越受到人們的關注。Ringholm A[7]等研究指出，金魚MC4R基因（gMC4R）在攝食上發揮作用，根據同源性比對，金魚MC4R基因與人MC4R基因有68%相同，并且保存了重要功能領域。金魚MC4R基因還參與體色的控制。其他魚類如河豚魚、斑馬魚、翻車魚、鯉魚中也有MC4R基因序列。將MC4R基因作為一個候選基因用于篩選與動物生長性狀相關聯的單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）位點已經得到了廣泛的應用。劉福平[8]等在對羅非魚MC4R基因克隆及與其生長相關的SNPs位點的分析中，對羅非魚MC4R基因啟動子和外顯子區域進行了SNPs位點的檢測和分型，結果共檢測到5個SNPs位點。

生物基因進化樹是生物學家根據生物進化序列制成的樹狀結構，微觀分子水平上的進化樹（基因樹）是20世紀50年代分子生物學問世之后形成的，可使人們直觀、簡明地認識地球上生物之間的親緣和進化關系。如能找到影響抗浪魚體重增長的基因無疑會帶來巨大的經濟價值和研究價值。試驗根據鯽魚的MC4R基因保守區的核苷酸序列設計1對引物，對抗浪魚的MC4R基因進行提取、PCR擴增、測序，并與其他魚類進行同源性分析，構建基因進化樹，以期為進一步了解抗浪魚MC4R基因的功能提供基礎，并為抗浪魚MC4R基因的SNPs檢測和分型以及對抗浪魚的分子標記輔助育種提供理論基礎，為抗浪魚的種群恢復提供幫助。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物。抗浪魚，為云南澄江撫仙湖中的野生個體。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取。采用常規苯酚法抽提抗浪魚基因組DNA。

1.2.2 MC4R基因PCR擴增。用于MC4R基因多態檢測的引物序列參照文獻進行合成。引物由上海生工公司合成。其序列為：上引：5’TCATACCGAAATCACAGC3’，下引：5’TCAACATCTATCTCCCAAAC3’。PCR反應體系為：水38.5 μl，10×Buffer 6 μl，dNTP 2 μl，上引物0.6 μl，下引物0.6 μl，DNA模板2 μl，Taq酶0.4 μl。

1.2.3 反應條件。92 ℃預變性8 min，92 ℃變性50 s，53 ℃退火50 s，72 ℃延伸65 s，共35循環；之后72 ℃后延伸8 min。PCR產物送由金瑞斯生物科技有限公司測序檢測。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA的檢測

2.1.1 檢測結果。取溶解的抗浪魚的基因組DNA在含EB的1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳條件問130 V，35 min。在凝膠成像儀上觀察結果并掃描，結果見圖1。

3 結論與討論

研究表明，MC4R基因在動物體內下丘腦、胰腺、胃均有表達[9]，具有控制食欲、調節能量平衡的作用[10]。試驗獲得了完整的編碼區序列，測序結果顯示，抗浪魚MC4R基因的擴增長度為1 001 bp，外顯子996 bp。

試驗利用phylip軟件對抗浪魚和其他已知MC4R基因序列的魚類構建了基因進化樹并進行分析。根據圖譜顯示，M9和M8分別為紅旗東方豚和中華多紀豚，屬于同一物種，與M7黑青斑河豚是一個屬，從而證明試驗所采用的phylip軟件分析方法是正確的。也就是說，此進化樹圖譜具有一定科學性，可信度高。

經過分析發現抗浪魚與比目魚的親緣關系最遠，與斑馬魚的親緣關系最近。首先，抗浪魚與斑馬魚的親緣關系近，2種魚類的生活習性可能類似，那么抗浪魚是否可以向斑馬魚一樣生活在暖海域的沿岸，具有夜行性，特別是利用其嗅覺尋覓食物的特性，這是一個值得研究的課題；同時，可以嘗試將斑馬魚引進放入撫仙湖中的環境下養殖。這種思路對其他魚類也有借鑒意義。其次，抗浪魚價格昂貴，生長緩慢，資源缺乏，有義務對其進行保護。然而在試驗和開發的同時，避免不了捕捉抗浪魚。根據抗浪魚與其他魚類的親緣關系，如果努力找到親緣關系近，數量多，易成活，繁殖率高的魚類來代替抗浪魚做相關的研究。這對抗浪魚的保護具有重要的意義。

由此類推，撫仙湖魚類資源豐富，若對撫仙湖中的魚類進行基因分析和構建基因進化樹找到魚類之間的親緣關系，可以找到物種間的進化關系，可以找到撫仙湖魚類的起源，斷定魚類是否屬于該地土著魚種還是引進魚種，同時還可以進行魚類生活與撫仙湖水質環境的關系研究。抗浪魚的這一研究對此都有重大的指導意義和應用意義。

試驗根據鯽魚的MC4R基因保守區的核苷酸序列，采用引物設計軟件，對抗浪魚的MC4R基因設計出一對引物進行PCR擴增，然后純化測序，

測序結果顯示，抗浪魚MC4R基因的擴增長度為1 001 bp。同時利用phylip軟件對抗浪魚和其他已知MC4R基因序列的魚類構建了基因進化樹并進行分析。結果發現，抗浪魚與比目魚的親緣關系最遠，與斑馬魚的親緣關系最近，從而為進一步了解抗浪魚MC4R基因的功能提供基礎，便于研究抗浪魚與其它魚類的親緣與進化關系，為抗浪魚MC4R基因的SNPs檢測和分型以及對抗浪魚的分子標記輔助育種提供前提理論基礎，為抗浪魚的種群恢復提供一定的幫助。

參考文獻

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