云南4個地方雞種PRL外顯子5基因多態性研究

摘要 [目的]研究云南4個地方雞種PRL外顯子5基因的多態性。[方法]對云南地方雞種剝隘小種雞（BA）、大圍山微型雞（DW）、武定雞（WD）、鹽津烏骨雞（YJ）4個雞種PRL基因第5外顯子PCRSSCP進行檢測分析，并采用Progene，Editplus等軟件進行數據分析。[結果]PCRSSCP檢測分析發現，PRL外顯子5有4個SNP位點，均有多種基因型。在PRLexon5 681、742和816 bp處呈現基因多態性，剝隘小種雞、武定雞、鹽津烏骨雞有AA、BB和AB 3種基因型，大圍山微型雞有AA和AB 2種基因型。PRLRexon5 950 bp處有1個SNP，4種雞均有AA、BB和AB 3種基因型。[結論]A基因可能是影響繁殖性狀的優勢基因。

關鍵詞 云南地方雞種；PRL基因；PCRSSCP

中圖分類號 S831 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）17-05374-03

Abstract [Objective] To study PRL exon 5 gene polymorphism of four Yunnan indigenous chicken. [Method] PCRSSCP detection was conducted on PRL exon 5 gene of four Yunnan indigenous chicken（BA， DW， WD， YJ）， and data analysis was carried out by Progene and Editplus software. [Result] PRL exon 5 gene has four SNP sites， all have a variety of genotypes. The results showed that PRLexon5 681 bp and 742 bp and 816 bp has gene polymorphism， the breeds of BA， DW and WD have AA， BB， AB 3 genotype， the breeds of YJ have AA， AB genotypes. PRLRexon5 950 bp has one SNP site， the four chicken breeds have AA， BB， AB 3 gene type. [Conclusion] The results showed that the gene A may be the dominant genes which affect the reproductive traits.

Key words Yunnan indigenous chicken； PRL gene； PCRSSCP

催乳素是垂體前葉嗜酸性細胞分泌的多肽類激素，催乳素是垂體前葉嗜酸細胞分泌的多膚類激素，根據PRL基因敲除的動物模型，PRL是產乳和繁殖等功能所必需的[1]。Wong[2]等發現，抱窩時垂體PRL的mRNA和PRL含量分別為正常時的50倍和3倍。同時，下丘腦促性腺激素釋放激素GnRH（I及Ⅱ型）和垂體促黃體激素LH-B的mRNA減少。注射外源PRL除誘發抱窩行為外[3]，還導致性腺萎縮；血液中LH、睪酮和雌二醇含量下降；卵泡膜細胞芳香化酶mRNA顯著減少[4-5]。催乳素與家禽繁殖性狀密切相關，Miao and Burt（1999）將雞的PRL基因定位于2號染色體。筆者分析PRLexon5基因的多態性，旨在為云南地方雞種基因多態性的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗雞群及樣品采集

所用的試驗雞群是飼養于云南農業大學實習雞場隨機挑選的體質健康、生長正常的武定雞、鹽津烏骨雞、大圍山微型雞、剝隘小種雞4種雞種母雞50只（19周齡），試驗雞群在完全相同的飼養管理條件和相同營養水平環境下單籠飼養。采用靜翅采血方法在每只雞身上采集約2 ml血樣，記錄編號，保存于真空采血管（含抗凝劑）中，置于冰盒，帶回實驗室存于-20 ℃冰箱保存備用。

1.2 DNA提取

采用全血基因組DNA快速提取試劑盒進行基因組DNA的提取。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

1.3 PCR擴增

根據Ensembl數據庫中cPRL的全長DNA序列（登錄號：ENSGALG00000012671）應用Primer Primier3和Oligo6，篩選出GC含量相近、擴增片段長度和范圍適宜、不存在發夾結構和二聚體的序列。進行測序引物合成，引物由昆明毓秀生物公司合成，合成片段421 bp。上游引物序列：5’TTGCAGAACAAAGGGAGACA3’；下游引物序列：5’AAGGTATAAGCCATCCCAGCTA3’。PCR反應體系中Master mix緩沖液購自昆明毓秀生物公司，反應體系采用25 μl體系，參數如下：模版2 μl DNA，10 μl ddH2O，11 μl Master mix，1 μl Primer F，1 μl Primer R。

1.4 PCR反應操作步驟

94 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸 120 s，72 ℃延伸10 min；2～4步驟進行35個循環。

1.5 瓊脂糖電泳檢測

采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，所用的DNA Marker1購自昆明毓秀生物公司；參照片段由小到大依次是100、200、300、400、500、600和700 bp；Marker1點樣量為3 μl，PCR產物的點樣量為3 μl；DNA染料GOLD VIEW按1∶ 40混至瓊脂糖凝膠。UVP紫外透射儀凝膠成像系統觀察電泳結果并照相。

1.6 數據處理

采用DNA直接測序進行基因型分析，Popgene和Eidtplus進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增

圖1表明，1～11泳道PCR產物特異性較好，條帶亮度較好擴增片段大約在421 bp，結果表明，試驗目的片段可用。

2.2 PRL第5外顯子檢測

對PRLexon5基因進行測序，根據Genebank Blast進行搜索比對，發現有4處SNP。結果發現該片段在681 bp處有一個T→C的突變，測序產生3種基因型（圖2）；氨基酸編碼區沒有造成氨基酸突變。在742 bp處有一個G→C的突變，測序產生3種基因型（圖3），氨基酸編碼區由GTG→CTG，由纈氨酸（Val）突變為亮氨酸（Leu）；在816 bp處有一個C→T的突變，測序產生3種基因型，氨基酸編碼區由TAC→TAT，沒有造成氨基酸突變（圖4）。在950 bp處有一個C→T的突變，測序產生3種基因型（圖5），氨基酸編碼區由CTT→CCT，由亮氨酸（Leu）突變為脯氨酸（Pro）。

2.3 PRL第5外顯子SNP基因頻率、基因型頻率

從群體遺傳學角度分析統計了4種雞群體在PRLexon5的4對分段引物對PRL基因擴增片段的基因型、等位基因頻率（表1）。由表1可知，在681 bp處，對于4種雞，基因T的頻率較基因C的頻率占優勢，TT基因型為優勢基因型；在742 bp處，基因G的頻率較基因C的頻率占優勢，GG基因型為優勢基因型；在816 bp處，基因C的頻率較基因T的頻率占優勢，CC基因型為優勢基因型；在950 bp處，基因C的頻率較基因T的頻率占優勢，CC基因型為優勢基因型。剝隘小種雞、武定雞、鹽津烏骨雞在681、742和816 bp處均有AA、BB、AB 3種基因型存在，而大圍山微型雞只有AA和AB 2種基因型。在950 bp處，4種雞均有AA、AB和BB 3種基因型。

2.4 PRL第5外顯子多態信息量（PIC）、純合度（Ho）、雜合度（He）、卡方檢驗

對于一個群體而言，PIC（PIC>0.5為高度多態，0.250.5，大圍山微型雞在681、742、816 bp處為低度多態，在950 bp處為中度多態。剝隘小種雞、武定雞、鹽津烏骨雞在681、742、816、950 bp處雜合度較高，而鹽津烏骨雞雜合度比較低。經過卡方檢驗，發現在681、742、816 bp處4種雞均處于Hardyweinberg平衡（P>0.05），在950 bp剝隘小種雞、大圍山微型雞、武定雞處于Hardyweinberg平衡（P>0.05），鹽津烏骨雞處于非Hardyweinberg平衡（P<0.05）。

3 結論與討論

武定雞、鹽津烏骨雞、剝隘小種雞、鹽津烏骨雞均是云南地方的有名雞種，具有早熟易肥，肌纖維細，肉質鮮美，香味濃郁，滑嫩異常等優異的特征而著稱。試驗探索了武定雞、鹽津烏骨雞、剝隘小種雞、鹽津烏骨雞4個品種中PRL基因頻率、基因型頻率、多肽信息含量、雜合度以及哈溫平衡的分布情況，為我國地方優質雞的繁殖性能的改良和分子育種繁殖提供了理論依據。

在家禽中，基因多態性的研究是一個熱點，僅PRL基因多態性方面的研究成果已有可觀的研究成果。如季華[6]在內含子2上發現在在55 bp有一個T/C突變，該位點沒有引起氨基酸發生變化。洪坤月[7]發現在PRL基因調控區-378～-355 bp處的PRL pro位點存在24 bp的突變，在太湖雞檢測到一個SNP位點A269G。耿照玉等[8]發現PRL基因外顯子2的單核苷酸變異產生3種基因型，且在有一個SNPC67T導致Met轉變為Val。趙興濤等[9]對五龍鵝研究發現，PRL內含子2有3種基因型，1個SNP位點，由第38和39位點上GA堿基的插入/缺失產生。張高娜等[10]研究發現，PRL5′調控區有CC、DD 2種基因型，未檢測到CD型；對不同基因型個體測序還發現，在外顯子1上游﹢11處發現了一個G→T突變，等。在眾多對家禽基因多態性研究的相關文獻內，未發現與本研究相同的SNP位點。

試驗結果表明，在剝隘小種雞、大圍山微型雞、武定雞和鹽津烏骨雞681、742、816、950 bp大部分具有中度PIC，中度雜合度且Hardyweinberg平衡，表明這4個SNP位點從基因序列保守性來說，比較強，在品種的選育、遷徙和遺傳漂變等因素作用下處于動態平衡當中，它們的遺傳是隨機的；基因頻率的平衡對于群體穩定性有著直接的保證作用。另外，由于研究過程中，僅限于實驗室的分子理論方面，未能夠與家禽實際繁殖性狀進行關聯分析，在基因與性狀的關聯分析方面有待進一步的研究與探索。云南地方雞種與其他地方雞種在PRLexon5處的區別和差異性有待進一步的研究比較， 豐富基因多態性的研究，為地方雞種的選育，繁殖等方面做出貢獻，這都是以后可逐漸開展的研究方向。

參考文獻

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