銀中楊黑星病病原菌鑒定

摘要 [目的] 對(duì)銀中楊黑星病病原菌進(jìn)行鑒定。[方法]對(duì)黑龍江省哈爾濱市銀中楊上一葉部病害發(fā)病情況進(jìn)行了田間調(diào)查和采集病害標(biāo)本，并通過(guò)致病性測(cè)定、分子和形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合。[結(jié)果]分離得到的菌株為山楊黑星孢菌，為銀中楊黑星病病原菌Fusichadium tremulae（Fr.）。[結(jié)論]此前尚未見(jiàn)山楊黑星病菌引起銀中楊黑星病的報(bào)道。

關(guān)鍵詞 黑星病；銀中楊；病原菌

中圖分類(lèi)號(hào) S763.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）17-05451-02

Abstract [Objective] The aim was to study pathogen identification of Populus alba×berolinesis poplar scab. [Method] The field systematic investigation on popular leaf of Populus alba×berolinesis diseases in Harbin City， Heilongjiang Province was done combining the determination of pathogenic， molecular and morphological identification. [Result]The pathogen had been identified as Fusichadium tremulae（Fr.）. [Conclusion] The report on Populus alba×berolinesis poplar scab had not been seen.

Key words Poplar scad； Populus alba×berolinesis； Pathogen

銀中楊（Populus alba×berolinesis）是1961年黑龍江省森林與環(huán)境科學(xué)研究院以當(dāng)?shù)刂袞|楊（P.berolinensis）為父本，采自熊岳銀白楊（P.alba）為母本，經(jīng)人工雜交育種而成的新品種[1-2]。該品種具有生長(zhǎng)速度快，材質(zhì)優(yōu)良，樹(shù)干筆直，樹(shù)姿優(yōu)美，抗寒，抗病蟲(chóng)害等優(yōu)點(diǎn)，是三北地區(qū)防護(hù)林、速生豐產(chǎn)林和城鎮(zhèn)綠化主要優(yōu)良品種之一[3]。楊樹(shù)黑星病是由山楊黑星孢F.tremulae（Fr.）引起的，該病菌主要危害合作楊（P. opera）、胡楊（P.euphratica）、小葉楊（P.simoni）、密葉楊（P.talassica）、苦楊（P.laurifolia）、柔毛楊（P.pilosa）等，可導(dǎo)致楊樹(shù)苗圃和幼林均能感染，連續(xù)數(shù)年發(fā)病，導(dǎo)致樹(shù)勢(shì)衰弱，輕者影響生長(zhǎng)，重者整株枯死，嚴(yán)重制約了楊樹(shù)的生產(chǎn)發(fā)展[4-7]。筆者在黑龍江省哈爾濱市調(diào)查楊樹(shù)灰斑病時(shí)發(fā)現(xiàn)銀中楊的苗木、中幼林和大樹(shù)上有大面積的黑星病發(fā)生，危害較為嚴(yán)重，因此，對(duì)病原菌進(jìn)行了鑒定，并對(duì)病害發(fā)生程度進(jìn)行了初步調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料取自東北林業(yè)大學(xué)院內(nèi)2年生銀中楊苗木病葉標(biāo)本，研究標(biāo)本現(xiàn)保存在東北林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)科森林病理實(shí)驗(yàn)室。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 ml。

1.2 病原菌分離、形態(tài)鑒定

采用單孢分離方法，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將病葉上的孢子粘在水瓊脂培養(yǎng)基上，然后在解剖鏡下用細(xì)玻璃針將單個(gè)孢子挑出，轉(zhuǎn)接在PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基挑3～5個(gè)，共5皿，在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，獲得病葉上的致病菌。分離到的菌株編號(hào)為YH。形態(tài)鑒定方法：按照Ainswoth（1973）系統(tǒng)對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定[8]。

1.3 致病性測(cè)定

用分離得到的菌株YH菌絲塊接種，2年生銀中楊的健康葉片用75%乙醇表面消毒，將菌絲塊用鑷子搗碎，粘在葉子表面，然后噴無(wú)菌水用透光的塑料袋保濕48 h，后解除保濕，以無(wú)菌水處理為對(duì)照。觀察記錄發(fā)病情況。然后進(jìn)行再分離，方法同“ 1.2 ”。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 總DNA提取。采用賀偉等[9]的方法進(jìn)行總DNA提取。

1.4.2 ITS區(qū)PCR擴(kuò)增。

采用真菌通用引物ITS4進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系總體積為25 μl，反應(yīng)液：BSA 2.5 μl；10倍PCR buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl2 5 μl，2.5 mmol/L dNTP 1.8 μl，5 U/μl Taq酶0.15 μl，模板DNA 3 ng，引物ITS4（由上海生工生物工程有限公司合成）各1 μl（25 μmol/L），加ddH2O總體積達(dá)12.05 μl，然后PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.5 病害危害情況調(diào)查

于2013-07～09月在黑龍江省哈爾濱市對(duì)銀中楊黑星病進(jìn)行調(diào)查，了解銀中楊發(fā)病情況，所用病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

病原菌菌絲體生于葉面組織表面，在病葉上表面呈黑霉?fàn)罨蚓d毛狀；在顯微鏡下觀察分生孢子梗褐色，無(wú)隔，單生或簇生，大多數(shù)直立，少數(shù)稍微彎曲。分生孢子橢圓形或長(zhǎng)橢圓形，雙孢，少數(shù)三孢，（20.5～33.5）μm×（6.5～7.5）μm褐色。經(jīng)鑒定YH為山楊黑星孢菌F.tremulae（Fr.）。未發(fā)現(xiàn)其有性型。

菌落特征：病原在PDA上菌落為黑色，菌落顏色隨著時(shí)間推移逐漸變白，20 d生長(zhǎng)約7 cm，經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)在PDA培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢。

2.2 病原菌致病性

接種14 d后葉子上出現(xiàn)病斑，對(duì)照不發(fā)病。進(jìn)行鏡檢，其形態(tài)特征與分離到的病原菌特征一致。證明所分離到的病原菌為銀中楊黑星病致病菌。

2.3 病原菌菌株YH的分子鑒定

經(jīng)分子生物學(xué)輔助鑒定，YH擴(kuò)增得到單一片段，但用水作為陰性對(duì)照的CK沒(méi)能得到該片段。通過(guò)對(duì)ITS區(qū)的測(cè)序，得到長(zhǎng)度509 bp的rDNAITS基因序列（圖1），將得到的序列與GenBank中的序列進(jìn)行同源性比較分析，結(jié)果表明，銀中楊黑星病病原與楊黑星菌（Venturia populina楊黑星病有性型[7]）同源性高達(dá)99%。

3 結(jié)論與討論

目前有關(guān)楊樹(shù)黑星病的相關(guān)報(bào)道有劉福德等（1995年）、莫延德（2002年發(fā)生在胡楊幼苗上）聶俊青等（2008年發(fā)生在青楊樹(shù)苗木上），病情發(fā)生報(bào)道均來(lái)自青海省[4-5，10]。該研究對(duì)黑龍江省哈爾濱市銀中楊黑星病大面積發(fā)生屬首次報(bào)道，綜合所得菌株的致病性測(cè)定、形態(tài)特征和分子生物學(xué)特性的結(jié)果，可以確定引起銀中楊葉部病害的病原菌為山楊黑星孢菌（F.tremulae），并對(duì)銀中楊發(fā)生情況進(jìn)行了初步調(diào)查，為銀中楊黑星病后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 郭阿君，王志英，鄒麗.銀中楊揮發(fā)性有機(jī)物釋放動(dòng)態(tài)及其抑菌作用[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，39（12）：67-70.

[2] 呂偉強(qiáng)，丁宇，張樹(shù)軍，等.銀中楊楊樹(shù)葉化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2013（25）：620-623.

[3] 任廣英，范竹珊，許成啟，等.銀中楊生長(zhǎng)和生長(zhǎng)規(guī)律[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，28（5）：67-71.

[4] 劉福德.楊樹(shù)黑星病的初步研究[J].森林病蟲(chóng)通訊，1995（4）：8-9.

[5] 聶俊青，韓英，嚴(yán)作慶，等.青楊苗木黑星病的侵染規(guī)律及防治技術(shù)的研究[J].森林保護(hù)，2008（5）：33-36.

[6] 束慶龍，陳超燕，張歡，等.安徽楊樹(shù)病害種類(lèi)及其危害特征研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33（7）：1193-1195.

[7] HOLESKI L M，VOGELZANG A，STANOSZ G，et al.Incidence of Venturia shoot blight in aspen （Populus tremuloides Michx.）varies with tree chemistry and genotype[J].Biochemical Systematics and Ecology，2009，37：139-145.

[8] 邵力平，沈瑞祥，張素軒，等.真菌分類(lèi)學(xué)[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1984：297-339.

[9] 賀偉，任飛娟，郭利民，等.歐美楊潰瘍病的病原鑒定[J].林業(yè)科學(xué)，2009，45（6）：104-109.

[10] 莫延德.胡楊幼苗黑星病初步研究[J].陜西林業(yè)科技，2002（2）：54-55，64.