一種棉花細胞質雄性不育系線粒體RNA的提取方法

摘要[目的]獲得高質量的棉花細胞質雄性不育系線粒體RNA。[方法]以哈克尼西棉細胞質雄性不育系黃化苗為研究對象，對棉花線粒體RNA的提取方法進行探討。[結果]采取先分離出棉花線粒體再提取RNA的方法，最終獲得了質量較好的線粒體RNA（mtRNA）。[結論] 成功獲得了質量較高的mtRNA。

關鍵詞棉花；線粒體RNA提取；方法

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）29-10097-02

作者簡介鞏養倉（1981- ），男，河南淮陽人，助理研究員，碩士，從事棉花遺傳育種研究。

RNA作為遺傳和表達的媒介，是目前分子生物學實驗中重要的研究對象。線粒體是動植物及人類細胞重要的細胞器，具有半自主性，含有少量的DNA遺傳物質，且有一套相對獨立的轉錄翻譯系統，合成自身所需要的特異蛋白。研究發現，線粒體基因組與植物細胞質雄性不育密切相關[1-4]，并推測線粒體基因組重組或重排以及RNA編輯現象可能是導致植物細胞質雄性不育的重要原因[5-8]。因此，對線粒體基因組的研究成為細胞質雄性不育研究的熱點。提取高質量的線粒體DNA及RNA是進行這些研究的第一步，也是關鍵的一步。關于線粒體RNA的提取，在玉米[9]、 馬鈴薯[10]、油菜[11]等作物上已經相當成熟，而在棉花上，雖有關于棉花線粒體DNA提取方法的介紹[12-13]，但關于棉花線粒體RNA提取方法尚未見報道。為此，筆者對此進行了初步探討。

1材料與方法

1.1材料哈克尼西棉（Gossypium harknessii）細胞質雄性不育系種子（由中國農科院棉花研究所雜種優勢利用課題組提供）。

1.2方法

1.2.1材料準備。將哈克尼西棉細胞質雄性不育系種子經溫水浸泡4 h，種植于無菌沙中，30 ℃暗培養7 d左右，培養成黃化苗備用。

1.2.2試劑準備。緩沖液A： 0.05 mol/L TrisCl，0.5 mol/L Sucrose，0.005 mol/L EDTA·Na2，0.1%BSA，1%～2% PVP，0.005 mol/L巰基乙醇，pH 7.5；緩沖液B： 0.05 mol/L TrisCl，0.3 mol/L Sucrose，0.01 mol/L氯化鎂，1% PVP，pH 7.5；緩沖液C： 0.05 mol/L TrisCl，0.3 mol/L Sucrose，0.01 mol/L氯化鎂；緩沖液D： 0.01 mol/L TrisCl，0.6 mol/L Sucrose，0.002 mol/L EDTA·Na2，pH 7.5；RNA抽提液：2%CTAB，2%PVP，0.1 mol/L TrisHCl（pH 8.0），0.025 mol/L EDTA·Na2 （pH8.0），2.0 mol/L NaCl。混勻，加0.1%DEPC處理過夜，滅菌，用前加入終體積為2%的巰基乙醇。

氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V）；DEPC處理水；10 mol/L LiCl，加0.1%的DEPC處理過夜，滅菌，室溫保存；100%乙醇；70%乙醇用DEPC水配制，-20 ℃保存；3 mol/L醋酸鈉（pH 5.2），加0.1%的DEPC處理過夜，滅菌。

1.2.3線粒體制備。線粒體制備主要是將線粒體從細胞中分離出來并保證其完整性。由于低溫能夠減緩線粒體氧化，為保證線粒體在提取過程中的穩定狀態，整個操作都在冰上完成，并在無菌通風櫥內進行。步驟如下：① 收集黃化苗，棄根，用滅菌水洗滌2次，置于研缽中；② 加入約4倍體積的緩沖液A，將組織研磨成糊狀；③ 通過8層紗布過濾入50 ml離心管中，離心（2 400 r/min，4 ℃，10 min），以除去大的細胞碎片；④ 取上清，2 500 r/min冷凍離心10 min，以除去質體；⑤ 將上清液轉入新的離心管中，8 000 r/min離心35 min，棄上清；⑥ 沉淀用緩沖液B懸浮后，8 000 r/min離心20 min，棄上清；⑦ 沉淀用20 ml緩沖液C懸浮，再用長針頭注射器向管底緩緩注入20 ml緩沖液D，形成一個step梯度，冰浴30 min，然后8 000 r/min離心20 min，棄上清液；⑧ 沉淀再用20 ml緩沖液D懸浮，8 000 r/min離心20 min，重復2～3次，得到的沉淀即為線粒體。

1.2.4mtRNA提取。mtRNA的提取主要參照MA等[14]提取棉花總RNA的改良CTAB法，略有改動，具體步驟如下：①向沉淀中加入適量體積的提取液，65 ℃水浴10 min，劇烈振蕩；②加入等體積氯仿/異戊醇（24∶1，V/V）抽提，劇烈振蕩，10 000 r/min，4 ℃離心10 min，重復1～2次；③取上清，加入1/4體積的10 mol/L LiCl，混勻，4 ℃過夜沉淀；④10 000 r/min，4 ℃離心10 min，沉淀溶于DEPC處理水中；⑤加入等體積酚/氯仿抽提1次； ⑥取上清，加入1/10體積醋酸鈉，2.5倍體積的無水乙醇，-70 ℃沉淀至少30 min；⑦離心（12 000 r/min，4 ℃，15 min），70%乙醇洗滌沉淀，在超凈工作臺上風干mtRNA，用10 μl DEPC處理水溶解，儲存于-70 ℃冰箱。

1.2.5mtDNA檢測。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用1.2%瓊脂糖凝膠，取2 μl mtRNA樣品在小型電泳槽中進行電泳，電壓70 V，電泳時長30 min，用0.01%溴化乙錠（EtBr）溶液浸泡20 min，然后置于紫外燈下觀察并拍照保存。

2結果與分析

由圖1可知，沒有降解的mtRNA 能夠看見2條清晰的核糖體RNA帶（26S 和18S），且26S的亮度約是18S 的2倍。由此可知，該方法所提取的mtRNA基本達到此標準，質量可以滿足進一步的分子生物學試驗。

3討論

獲得高質量的核酸是進行分子生物學相關研究的關鍵環節，對下一步試驗的進行和結果都有很大的影響。RNA質量好壞主要體現在兩點：一是完好性，所提取的核酸能否體現在動植物體內的自然長度，是否發生了降解；二是純度，即是否有其他非核酸物質及DNA的污染，而對mtRNA而言，又要去除基因組RNA的污染。所以mtRNA的抽提，一方面要利用合適的方法去除雜質，另一方面要提供合適的環境，避免對核酸的損傷。

該試驗首先從細胞中分離出完整的線粒體，然后再提取RNA。該方法避免了基因組DNA和RNA的污染，但如何分離出完整的線粒體是試驗成敗的關鍵。線粒體是細胞中最為活躍的細胞器之一，極易發生氧化破裂，該研究參考國內外相關文獻并經過多次試驗，成功分離出棉花完整的線粒體。

針對RNA的抽提，前人已經做了大量的研究[15-17]。相對于其他植物而言，棉花RNA抽提具有其特殊性，棉花各組織特別是花藥、胚珠、纖維細胞內常含有豐富的多糖、脂類以及酚類等次生物質，如果這些物質不能有效地去除，會嚴重影響核酸的純度，進而影響后續試驗的進行，所以棉花RNA的抽提比其他植物更困難。該試驗采用提取棉花總RNA較為成熟的改良CTAB法提取線粒體中的RNA，獲得了質量較高的mtRNA。但該方法由于操作較繁瑣，造成mtRNA的嚴重流失，該試驗中，應用約20 g新鮮材料最后只得到了約0.5 μg的mtRNA，雖然質量能夠滿足一般試驗的要求，但數量不足，很難完成對RNA數量要求較多的分子試驗，如Northern雜交。所以如何提取出高質量高產出比的mtRNA，還需要進一步地探討。

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