復(fù)方霍山石斛含片清咽功能的動物試驗研究

摘要[目的]研究復(fù)方霍山石斛含片是否具有清咽功能。 [方法]根據(jù)國食藥監(jiān)?；痆2012]107號文件清咽功能動物試驗要求，采用大鼠棉球植入、大鼠足趾腫脹、小鼠耳廓腫脹3種試驗方法。具體將80只健康雄性大鼠、40只健康雄性小鼠按體重隨機分2個大組，每個大組按低、中、高和空白對照4個劑量組[0.27、0.53、1.60、0 g/（kg·bw·d）]，連續(xù)灌胃32 d后分別對不同劑量組進行棉球植入試驗（肉芽腫的形成及測定）、足趾腫脹試驗及測定、耳腫脹試驗及測定。 [結(jié)果]1.60 g/（kg·bw·d）組肉芽腫凈量低于0 g/（kg·bw·d）組；0.53、1.60 g/（kg·bw·d）組1、2、4 h足趾腫脹率均低于0 g/（kg·bw·d）組，1.60 g/（kg·bw·d）組6 h足趾腫脹率低于0 g/（kg·bw·d）組；1.60 g/（kg·bw·d）組耳廓腫脹率低于0 g/（kg·bw·d）組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。 [結(jié)論]復(fù)方霍山石斛含片清咽功能的動物試驗結(jié)果為陽性，具有清咽功能。

關(guān)鍵詞霍山石斛；含片；清咽功能；動物試驗

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）29-10131-03

作者簡介 陳鋒（1983- ），男，安徽六安人，在讀碩士，從事保健食品研發(fā)。*通訊作者，藥師，在讀碩士，從事制藥工程研究。

復(fù)方霍山石斛含片是以霍山石斛提取物、百合提取物、玉竹提取物為主要原料，同時添加甘露醇、薄荷腦、三氯蔗糖等輔料制成的保健食品。含有多種生物活性物質(zhì)，其中石斛多糖、玉竹多糖、百合多糖具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用[1-3]。目前對石斛清咽的功能已有報道[4]，但對以上3種中藥配伍后具有清咽功能的研究未見報道。因此，筆者根據(jù)國食藥監(jiān)?；痆2012]107號文件中清咽功能動物試驗的相關(guān)要求，從大鼠肉芽腫、大鼠足趾腫脹率、小鼠耳腫脹3個方面研究復(fù)方霍山石斛含片對大、小鼠清咽功能的影響，旨在證明該產(chǎn)品是否具有清咽功能。

1材料與方法

1.1樣品復(fù)方霍山石斛含片，規(guī)格為0.8 g/片×40片/瓶，批號130208，樣品性狀為黃棕色至棕褐色片劑，密封、置陰涼干燥處保存。由九仙尊霍山石斛股份有限公司提供，受試樣品人體推薦劑量為3.2 g/（人·d）。

1.2試驗動物選用上海西普爾-必凱實驗動物有限公司繁殖的SPF級SD健康雄性大鼠80只、SPF級BALB/C健康雄性小鼠40只，生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2008-0016，合格證編號2008001634293、2008001634294。大鼠各平行試驗組初始體重范圍為157～180 g，小鼠各平行試驗組初始體重范圍為19.7～21.9 g。試驗動物在溫度為20～25 ℃、相對濕度為40%～70%的本中心屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)。試驗動物使用許可證號SYXK（蘇）2012-0041。輻照滅菌飼料由蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司提供，批準文號蘇飼審（2009）05032。

1.3劑量選擇與受試物給予方式復(fù)方霍山石斛含片人體推薦量為每人每日3.2 g（按60 kg體重計），設(shè)低、中、高3個劑量組即0.27、0.53、1.60 g/（kg·bw·d），分別相當于人體推薦攝入量5倍、10倍、30倍，另設(shè)0 g/（kg·bw·d）（溶劑）對照組以無菌水代替受試物。受試樣品用無菌水配制，低、中、高劑量配制濃度分別為27、53、160 mg/ml，按1.0 ml/（100 g·bw）灌胃。經(jīng)口每日一次給予大、小鼠相應(yīng)濃度的受試樣品，連續(xù)灌胃32 d后進行指標測定。

1.4主要儀器與試劑T1000型電子天平、JA2003型電子天平、恒溫干燥箱、脫毛器、足趾容積測量儀、打孔器，乙醚、碘伏、葡聚糖4萬、無菌蒸餾水、二甲苯。

1.5試驗方法根據(jù)國食藥監(jiān)保化[2012]107號文件中清咽功能。大鼠適應(yīng)環(huán)境3 d，按體重隨機分為Ⅰ、Ⅱ 2個大組，每個大組分為4個劑量組，每個劑量組10只大鼠；按各劑量連續(xù)給樣32 d后，Ⅰ組大鼠進行棉球植入試驗，Ⅱ組大鼠進行足趾腫脹試驗。小鼠適應(yīng)環(huán)境3 d，按體重隨機分為4個劑量組，每個劑量組10只小鼠；按各劑量連續(xù)給樣32 d后，進行小鼠耳腫脹試驗。

1.5.1大鼠棉球植入試驗。

1.5.1.1棉球的處理。將脫脂棉制成約20 mg緊致的小棉球，經(jīng)高壓滅菌后，置恒溫干燥箱60 ℃干燥3 h，取出無菌條件下稱重，干燥保存，備用。

1.5.1.2肉芽腫的形成和測定[5]。試驗結(jié)束前8 d?、窠M大鼠，用脫毛器脫去大鼠兩側(cè)腹股溝處的毛，乙醚淺麻醉大鼠，碘伏消毒，在無菌條件下切開大鼠兩側(cè)腹股溝皮膚，植入備用的棉球，縫合切口，繼續(xù)給予受試物。試驗結(jié)束當天，給受試物1 h后，斷頸處死大鼠，在原縫合處剪開皮膚，剝離并取出棉球肉芽組織，置于已稱重潔凈平皿中，恒溫干燥箱60 ℃開蓋干燥1 h后稱重。計算肉芽腫凈量，肉芽腫凈量（mg）=干燥后棉球肉芽腫重量-原棉球重量。試驗組與溶劑對照組比較，肉芽腫凈量明顯下降，經(jīng)統(tǒng)計處理差異有顯著性，可判定該受試樣品大鼠棉球植入試驗結(jié)果陽性。

1.5.2大鼠足趾腫脹試驗。

1.5.2.1 致炎劑的配制。用無菌蒸餾水配制濃度為1%的葡聚糖4萬，備用。

1.5.2.2足趾腫脹及測定。試驗結(jié)束當天取Ⅱ組大鼠再給受試樣品一次，1 h后，用足趾容積測量儀測量各組大鼠右后足趾的容積，作為0 h足趾容積。然后在大鼠右后足趾皮下注入1%葡聚糖4萬0.1 ml/只，分別于1、2、4、6 h測量大鼠足趾的容積，同一部位測量3次，取平均值。以不同時間所測足趾容積與致炎劑作用前的足趾容積之差為腫脹值，計算各個時間段的足趾腫脹率，腫脹率（%）=腫脹值/致炎前足趾容積×100%。試驗組與溶劑對照組比較，任一時間點刺激前后足趾容積腫脹率明顯減少，差異有顯著性，可判定該受試樣品大鼠足趾腫脹試驗結(jié)果陽性。

1.5.3小鼠耳腫脹試驗[6]。取小鼠，汲取二甲苯20 μl，滴加在小鼠右耳外側(cè)面耳廓的中央，讓其自由擴散，30 min后，將小鼠脫頸椎處死，剪下雙耳，用9 mm直徑打孔器在兩耳相同部位打下耳片并稱重，以兩耳重量之差為耳廓腫脹值，計算耳廓腫脹率，耳廓腫脹率（%）=耳廓腫脹值/對照耳片重量×100%。試驗組與溶劑對照組比較，耳廓腫脹率明顯減少，差異有顯著性，可判定該受試樣品小鼠耳腫脹試驗結(jié)果陽性。

1.6試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計用SPSS統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。計量資料采用方差分析，需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，滿足方差齊要求的數(shù)據(jù)，用多個試驗組與一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。

1.7結(jié)果判定大鼠棉球植入試驗結(jié)果陽性，同時大鼠足趾腫脹試驗或小鼠耳腫脹試驗結(jié)果任意一項陽性，可判定該受試樣品具有清咽功能。

2結(jié)果與分析

2.1復(fù)方霍山石斛含片對大、小鼠體重的影響由表1～2可見，0.27、0.53、1.60 g/（kg·bw·d）組大鼠、小鼠的初始體重與0 g/（kg·bw·d）（溶劑）組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），即大鼠、小鼠的初始體重在各組間較為均衡。經(jīng)口給予大鼠不同劑量的復(fù)方霍山石斛含片32 d后，各劑量組大鼠、小鼠體重及增重進行方差齊性檢驗，滿足方差齊的要求，用單因素方差分析方法中多個試驗組與一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.27、0.53、1.60 g/（kg·bw·d）組大鼠、小鼠體重及增重與0 g/（kg·bw·d）（溶劑）組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.2復(fù)方霍山石斛含片對大鼠肉芽腫形成的影響經(jīng)口給予大鼠不同劑量的復(fù)方霍山石斛含片24 d后，大鼠兩側(cè)腹股溝植入備用棉球，繼續(xù)給予受試物8 d，試驗結(jié)束當天取出棉球肉芽組織，干燥后稱重并計算肉芽腫凈量。肉芽腫凈量進行方差齊性檢驗，滿足方差齊要求，用單因素方差分析方法中多個試驗組與一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計處理。由表3可見，1.60 g/（kg·bw·d）組肉芽腫凈量低于0 g/（kg·bw·d）組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3復(fù)方霍山石斛含片對大鼠足趾腫脹情況的影響經(jīng)口給予大鼠不同劑量的復(fù)方霍山石斛含片32 d后，測量各組大鼠右后足趾的容積，根據(jù)不同時點所測量的容積計算相應(yīng)的

2.4復(fù)方霍山石斛含片對小鼠耳腫脹試驗的影響經(jīng)口給予小鼠不同劑量的復(fù)方霍山石斛含片32 d后，以二甲苯刺激小鼠右耳后，打下左右兩耳片稱重，以兩耳差為耳廓腫脹值，計算耳廓腫脹率，將耳廓腫脹率進行方差齊性檢驗，滿足方差齊要求，用單因素方差分析方法中多個試驗組與一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計處理。由表5可見，1.60 g/（kg·bw·d）組耳廓腫脹率低于0 g/（kg·bw·d）組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3小結(jié)

復(fù)方霍山石斛含片以0.27、0.53、1.60 g/（kg·bw·d）的劑量連續(xù)灌胃大、小鼠32 d后，結(jié)果可見，大鼠棉球植入試驗，1.60 g/（kg·bw·d）組肉芽腫凈量低于0 g/（kg·bw·d）組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），此項試驗結(jié)果陽性；大鼠足趾腫脹試驗，0.53、1.60 g/（kg·bw·d）組1、2、4 h腫脹率均低于0 g/（kg·bw·d）組，1.60 g/（kg·bw·d）組6 h腫脹率低于0 g/（kg·bw·d）組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），此項試驗結(jié)果陽性；小鼠耳腫脹試驗，1.60 g/（kg·bw·d）組耳廓腫脹率低于0 g/（kg·bw·d）組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05），此項試驗結(jié)果陽性。根據(jù)國食藥監(jiān)?；痆2012]107號中清咽功能動物試驗的結(jié)果判定，在該試驗條件下復(fù)方霍山石斛含片具有清咽功能。

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