銅藻多糖水提法工藝優化及其抗氧化活性研究

摘要[目的]研究銅藻多糖的水提法提取工藝，并研究其抗氧化活性。[方法]采用水提法提取銅藻多糖，研究提取時間、提取溫度和料液比等因素對多糖提取率的影響，以多糖得率為指標，通過正交試驗優化最佳提取工藝；并對銅藻多糖的1，1二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基、超氧陰離子自由基（O-2）的清除能力及抗脂質過氧化能力進行研究。[結果]該多糖水提法提取的最優條件為料液比1∶20 g/ml、時間3 h、溫度60 ℃，在此條件下，銅藻多糖的提取率為4.9%；銅藻多糖抗氧化活性隨著濃度增加而增強，其超氧陰離子（O-2）和DPPH自由基清除能力、抗脂質過氧化能力分別為48.1%、38.8%、34.2%。[結論]該研究優化了銅藻多糖的提取工藝，提取的活性多糖具有一定抗氧化活性，試驗優化的工藝穩定可行，為銅藻多糖的后續研究和開發提供依據。

關鍵詞銅藻；多糖；水提；抗氧化活性；工藝優化

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）29-10139-03

基金項目舟山市科技計劃項目（2012C33004）；2012年浙江海洋學院大學生科技創新項目“銅藻糖膠制備技術研究”；浙江海洋學院2012年科研計劃項目（面上項目）（X12M05）；浙江海洋學院科研啟動經費資助項目“海藻多糖硫酸酯的抗氧化活性研究”。

作者簡介顧麗霞（1992- ），女，浙江杭州人，本科生，專業：藥學。*通訊作者，講師，博士，從事海洋天然產物與健康研究工作。

銅藻Sargassum herneri（Turn）C.Ag.俗稱“丁香屋”，已用于藻膠制造工業，在農業、生物醫藥、食品、飼料工業等行業也被廣泛應用，具有較高的商業價值。民間存有銅藻全藻藥用的習慣，其有效成分特別是有生物活性的特效成分研究得仍較少，僅見報道含褐藻酸、甘露醇、多糖等成分[1-2]，因而該藻并未得到有效的開發利用。近些年來，我國對海洋來源多糖的研究日益廣泛，已有研究表明海洋多糖具有抗衰老、抗輻射、抗病毒、抗心血管疾病及抗氧化活性等功能[3-7]，其中，海藻多糖的開發已逐漸全球化，成為重要的一個領域。在十幾年前，從褐藻中分離出有較強藥理學和生物化學活性的硫酸基多糖吸引了許多學者們的關注，闡明了褐藻硫酸多糖具有抗凝血、抗感染、抗炎癥和抗腫瘤等活性[8-10]。為了提高效率、節約成本，筆者采用熱水提取法提取銅藻中的多糖，采用正交試驗法優化銅藻多糖的提取工藝，并對其體外抗氧化活性進行研究，為后續銅藻多糖的開發和利用提供依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試原料。銅藻（舟山嵊山島采得）由浙江海洋學院藥學系鑒定。

1.1.2主要儀器。UV1100紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；FW80萬能粉粹機，天津市泰斯特儀器有限公司；HWS12電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；SB4200DT 超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；FEB852恒溫磁力攪拌器，常州國華電器有限公司。

1.1.3試劑。葡萄糖、濃硫酸、苯酚、無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸等，均為分析純。

1.2方法

1.2.1多糖的提取。取銅藻粉末20 g，過20目篩，經熱水提取法提取后，離心，并取溶液，加入H2O2（3%），4 ℃處理2 h，濃縮后加入乙醇，使乙醇含量為70%，沉淀過夜，抽濾，濾渣加水溶解，采用Sevage法脫蛋白，將溶液在旋轉蒸發儀上旋干，加少量水溶解，加入乙醇進行二次醇沉，同樣，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚淋洗兩次，揮干溶媒，加少量蒸餾水溶解，冷凍干燥的固體即為銅藻多糖。

1.2.2標準曲線的繪制。采用苯酚-硫酸法[11]測定多糖含量。精密稱取0.050 g葡萄糖（分析純），加水定容至100 ml，得到濃度為500 μg/ml的葡萄糖標準溶液，精確吸取0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 ml，分別置于10 ml容量瓶中，補加超純水至2.0 ml，加入1.0 ml苯酚（5%），混合均勻后快速加入7.0 ml濃硫酸（95%），搖勻后室溫放置30 min，于485 nm處測定其紫外吸光值（A）。以吸光值A為橫坐標、葡萄糖的質量濃度為縱坐標，繪制標準曲線（圖1）。

圖1葡萄糖標準曲線1.2.3多糖含量的測定。精確量取供試品溶液1 ml，加蒸餾水至2 ml后，加1 ml 5%苯酚，搖勻后迅速加入濃硫酸 7.0 ml，搖勻后冷卻至室溫，按照“1.2.2”中的方法測定吸光度。以吸光度對應的葡萄糖標準品溶液濃度乘以校正系數0.9，計算多糖含量。

1.2.4提取工藝單因素試驗。

1.2.4.1最佳溫度確定。取海藻20 g，在料液比1∶20 g/ml，提取時間為4 h，分別以50、60、70、80 ℃的提取溫度，考察提取溫度對銅藻多糖提取率的影響。

1.2.4.2最佳料液比確定。取海藻20 g，溫度60 ℃，水提時間4 h，分別以料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/ml的條件下，考察料液比對銅藻多糖提取率的影響。

1.2.4.3最佳時間確定。取海藻20 g，溫度60 ℃，料液比1∶15 g/ml，分別以提取時間為2、4、6、8、9 h的條件下，考察提取時間對銅藻多糖提取率的影響。

1.2.5提取工藝的正交試驗。以提取溫度、提取時間以及料液比3個因素為考察對象，每個因素3個水平，選用三因素三水平正交試驗（表1），篩選銅藻多糖的最佳提取工藝。

1.3水提法的銅藻多糖抗氧化活性研究

1.3.1DPPH自由基清除的測定[12]。取不同濃度（0、2、4、6、8和10 mg/ml）的樣品溶液1.0 ml加入4.0 ml 0.004% DPPH溶液，混勻，避光放置30 min，以無水乙醇作為對照空白在517 nm測定其吸光度A，以Vc作為陽性對照，清除率T（%）= [（A0-A1）/A0]×100%，式中，A0為對照空白吸光度值；A1為待測液吸光度值。

1.3.2抗脂質過氧化能力的測定[13]。用磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1 mol/L、pH 7.45）配制卵黃懸液[V（PBS）∶V（卵黃）=25∶1]，取0.4 ml卵黃懸液，分別加入不同濃度（0、2、4、6、8和10 mg/ml）的被測溶液1.0 ml，再加入0.4 ml、25 mmol/L的硫酸亞鐵，用0.1 mol/L、pH 7.45的PBS補充至4.0 ml，37 ℃氣浴恒溫振蕩器中振蕩15 min，取出后加入1.0 ml、20%的三氯乙酸（TCA）靜置10 min，3 500 r/min 離心10 min，取4.0 ml上清液加入2 ml、0.8%的硫代巴比妥酸（TBA），加塞，沸水浴15 min，冷卻，以6.0 ml PBS為空白調零管，在532 nm處測定吸光度；Vc作為陽性對照組，多糖抗氧化活性以抑制卵黃脂蛋白脂質過氧化效率表示，抑制率I（%）=（A0-A）/A0×100%，式中，A0為空白對照（未加多糖）的吸光度；A為待測多糖的吸光度。

1.3.3超氧陰離子自由基清除能力的測定[14]。在試管中分別加入pH為8.2、濃度0.05 mol/L的TrisHCl緩沖液3 ml，每個試管加入不同濃度（0、2、4、6、8和10 mg/ml）的樣品0.20 ml（對照用蒸餾水代替），并于25 ℃電熱恒溫水浴鍋中保溫10 min，加入同樣預溫的30 mmol/L的鄰苯三酚12 μl，混勻后精確反應4 min，0.50 ml濃鹽酸終止反應，在320 nm處測吸光度，以等體積pH為8.2的TrisHCl緩沖液作為空白，以Vc作為陽性對照。清除能力T=（A對照-A樣品）/（A對照-A空白）×100%，式中，A空白為TrisHCl緩沖液的吸光度值；A對照為TrisHCl緩沖液+鄰苯三酚溶液（未多糖）的吸光度值；A樣品為多糖的吸光度值。

2結果與分析

2.1單因素試驗從圖2可以看出，銅藻多糖提取率隨溫度升高先升高再降低，在70 ℃時提取率最高，達0.849 7%，在一定范圍內，溫度升高有助于多糖滲出而溫度超出最佳條件后，其提取率呈下降趨勢；提取率隨料液比增加先升高后降低，在1∶20時，提取率最高。提取率隨提取時間的增加，逐漸升高，4 h后提取率略下降，從圖2可知提取時間對提取率的影響較顯著。

2.2正交試驗試驗結果（表2）表明，提取時間、溫度以及料液比3種因素對銅藻多糖提取效率的影響大小依次為C>A>B，即提取溫度>提取時間>料液比。銅藻多糖最佳提取工藝為A1B1C2，即提取時間3 h、提取溫度60 ℃、料液比1∶20 g/ml。

2.3抗氧化活性測定結果由圖3可見，在不同濃度下，銅藻多糖對DPPH自由基具有一定的清除能力，呈一定的濃度依賴性，濃度為10 mg/ml 時，其清除率達38.8%，低于陽性對照組（Vc組）；水提法提取的銅藻多糖具有較強的抗脂質過氧化能力，并與濃度呈正相關，濃度為8 mg/ml 時，多糖抗脂質過氧化能力最高，為48.1%，但低于陽性對照組（Vc組為75.0%）；銅藻粗多糖有超氧自由基清除能力，濃度為10 mg/ml 時，其清除能力為34.2%，其超氧自由基清除能力隨濃度的增加而增強，但明顯低于Vc（清除能力為92.1%）。

3結論與討論

海藻具有陸生植物所不具備的生態條件，造就了其具有特殊分子結構及生理、生化特性，其所含的多糖具有特殊的醫用功能，對治療人類的慢性疾病有顯著療效，因此開發和利用海洋藻類代謝產物具有重大意義[15]。海藻多糖的提取工藝及其活性研究，主要集中在羊棲菜、海帶等藻類，銅藻多糖提取工藝及其體外抗氧化能力的相關研究報道不多，該研究分析了銅藻多糖提取條件，并對其主要影響因子（提取溫度、提取時間、料液比）進行了優化，結果表明，影響銅藻多糖提取率的主要因素為提取溫度和時間，料液比為其次，其最優的提取工藝為：在料液比1∶20 g/ml、60 ℃下提取3 h。該方法（水提法）既節約成本又易于操作的藻類提取有效方法，具有提取工藝簡單、能耗低、提取率高等優點，因而易于推廣到實際生產中，有望實現銅藻多糖提取的產業化。

該研究對銅藻多糖的DPPH自由基清除能力、抗脂質過氧化能力以及超氧陰離子（O-2）清除能力進行評價，結果表明，該多糖在體外具有一定的抗氧化能力，其抗氧化能力隨著濃度的增加而增強，這與劉麗佳等采用酶法提取的銅藻多糖相比[16]，抗氧化活性有一定的增強，表明不同提取條件可能影響了多糖的活性，但較Vc弱，這有可能與其純度不高有關，需要進行深入研究。通過對銅藻多糖提取工藝的優化，并探討了其體外抗氧化能力，表明銅藻多糖具有一定的抗氧化能力，該試驗為銅藻資源的研究和開發利用提供依據。

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