小麥自噬相關基因ATG4和ATG8的原核表達及蛋白純化

摘 要：細胞自噬與植物生長、發育和逆境響應等過程密切相關。本研究構建了小麥重要自噬相關基因TaATG4a和TaATG8h的原核表達載體并導入大腸桿菌。IPTG誘導表達后的蛋白質SDS-PAGE電泳結果表明，兩個基因在大腸桿菌中均能夠高效表達，表達重組蛋白的分子量與預測分子量基本一致。利用Ni柱親和層析方法進一步獲得了純度較高的重組蛋白，為今后的體外酶活分析、抗體制備和Western雜交等研究奠定了基礎。

關鍵詞：細胞自噬；小麥；ATG4；ATG8；原核表達

中圖分類號：S512.1 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.05.004

胞自噬（Cell autophagy）是廣泛存在于真核細胞中的一種溶酶體（酵母、植物為液泡）依賴性降解途徑，用于凈化自身多余或受損細胞結構和大分子、促進生物大分子循環利用[1]。細胞自噬過程中，首先是批量細胞質成分或細胞器被雙層膜結構包圍，形成自噬小體（Autophagosome），隨后自噬小體外膜與溶酶體膜融合，將內膜及包圍物質（自噬小泡，Autophagic body）送入溶酶體腔進行消化[2]。ATG4和ATG8是兩個重要自噬相關基因（Autophagy-related gene， ATG）。ATG8蛋白前體的C端經具有半胱氨酸蛋白酶活性的ATG4酶切后暴露出保守的甘氨酸殘基。此后，ATG8經一個類泛素結合系統與脂類物質磷脂酰乙醇胺（PE）相連形成ATG8-PE。ATG8-PE定位于自噬膜上，對于自噬膜的裝配、延伸、合攏及與液泡的融合過程都具有重要意義。ATG4對ATG8的酶切加工是ATG8進入類泛素連接系統的前提。ATG4又能從ATG8-PE和自噬膜上釋放ATG8，ATG8從自噬膜上的釋放是促進自噬小體成熟并成為可融合形式的重要環節。細胞自噬在進化過程中高度保守。植物上，擬南芥基因組分析發現了36個ATG基因[3]，煙草[4]、水稻[5]、玉米[6]、大豆[7]和小麥[8]等作物上ATG基因的鑒定和分析也相繼被報道。擬南芥上的研究表明，ATG4和ATG8在植物細胞自噬中同樣扮演了與酵母類似的重要角色[9-10]。

細胞自噬與植物生長、發育及響應多種生物、非生物脅迫，包括營養缺乏、氧脅迫、鹽脅迫、干旱脅迫和病原侵染等的反應過程密切相關[11]。到目前為止，有關細胞自噬的分子機理和生理功能研究仍然僅限于擬南芥等模式物種上，在重要農作物尤其是小麥上的報道很少。本研究在前期成功克隆多個小麥重要ATG基因的基礎上，構建了ATG4和ATG8基因的原核表達載體，經大腸桿菌誘導表達和重組蛋白純化過程獲得了小麥ATG4和ATG8的純化重組蛋白，可為下一步體外酶活測定、抗體的制備和Western雜交等試驗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 基因和載體

小麥自噬相關基因TaATG4a和TaATG8h由本實驗室（天津市動植物抗性重點實驗室）克隆。兩個基因全長cDNA分別克隆于pGEM-Teasy載體上。原核表達載體pET30a由本實驗室保存。

1.2 原核表達載體的構建

設計合成兩端添加NotⅠ識別位點的PCR引物對4aNOTI-F （ATAAGAATGCGGCCGCATGACGAGCTTGCCTGAGAG）/4aNOTI-R （ATAAGAATGCGGC CGCTCAGAGAATCTGCCACTCAT） 和8hNOTI-F（ATAAGAATGCGGCCGCATGAAGTCC TTCAAGAAGGA）/8hNOTI-R（ATAAGAATGCGGCCGCTCACCCAAATGTCTTCTCGC），使用pfu DNA聚合酶從pGEM-Teasy載體上分別擴增TaATG4a和TaATG8h基因的全長ORF。擴增產物NotⅠ-NotⅠ片段經酶切、連接過程克隆到原核表達載體pET30a的NotⅠ位點處，測序鑒定正確插入方向（起始密碼子ATG緊鄰T7啟動子）的重組表達載體pET-ATG4a和pET-ATG8h。采用熱激法將表達載體導入到大腸桿菌BL21（DE3）中。

1.3 原核表達

接種含重組載體質粒的大腸桿菌BL21（DE3）到LBK液體培養基中（含50 mg·L-1卡那霉素），37 ℃振蕩培養過夜。按1%的比例擴大到5 mL LBK液體培養基中（卡那霉素 50 mg·L-1），37 ℃振蕩培養至OD600達到0.6～0.8。加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，于28 ℃條件下震蕩培養誘導目標基因的表達。分別于誘導后0，2，4，6，8 h取1 mL菌液用于總蛋白的SDS-PAGE電泳分析。

1.4 SDS-PAGE電泳

將1 mL菌液10 000 r·min-1離心10 min，棄上清后加入80 μL的ddH2O重懸沉淀，再加入20 μL電泳上樣緩沖液（5X）并混勻，沸水浴10 min。12 000 r·min-1離心5 min，取上清用SDS-PAGE凝膠電泳（13%分離膠，4%濃縮膠）分離蛋白。電泳后用考馬斯亮藍（R-250）染色液染色1 h，脫色液脫色至背景無色后觀察并拍照。

1.5 重組蛋白的純化

重組蛋白為N端含組氨酸標簽His（6）的His（6）-TaATG4a或His（6）-TaATG8h，因此使用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒（康為世紀），在非變性條件下經 Ni 柱親和層析過程純化重組蛋白。層析柱的平衡、菌體的超聲波破碎和可溶性蛋白的上樣及雜蛋白的清洗等過程參照試劑盒手冊進行。分別使用5 mL含50，100，200，300和500 mmol·L-1 咪唑的洗脫液分段洗脫目標蛋白。收集各階段的洗脫液進行SDS-PAGE（13%分離膠，4%濃縮膠）電泳和考馬斯亮藍（R-250）染色、脫色分析。純化的蛋白質溶液（洗脫液）-80 ℃冰箱保存。

2 結果與分析

2.1 小麥TaATG4a和TaATG8h的原核表達

構建了小麥TaATG4a和TaATG8h基因的原核表達載體。將表達載體pET-ATG4a和pET-ATG8h分別轉化到大腸桿菌BL21（DE3）菌株中。如圖1和2所示，未經IPTG誘導的大腸桿菌總蛋白中目標蛋白表達微弱。而經IPTG 誘導，兩個載體均正確表達出了重組蛋白His（6）-TaATG4a和His（6）-TaATG8h，實際分子量與理論分子量（His（6）-TaATG4a：59.25 kDa；His（6）-TaATG8h：20.22 kDa）基本一致。28 ℃培養條件下，His（6）-TaATG4a的表達量在誘導后0～8 h時間段內隨誘導時間的延長逐漸增加（圖1），而His（6）-TaATG8h在誘導后2 h 即可實現高效表達（圖2），且其表達量并未隨著時間的增加而有明顯的變化。電泳上樣樣品為大腸桿煮沸液的上清部分，表明兩個重組蛋白在可溶性部分中的表達量足夠高，滿足純化要求，這為后續非變性條件純化過程的選擇提供了依據。

2.2 小麥TaATG4a和TaATG8h重組蛋白的純化

鑒于目標蛋白N端融合了His（6）組氨酸標簽，采用Ni 柱親和層析方法純化總可溶性蛋白中的目標蛋白。如圖3和4所示，流穿液中目的蛋白較少。經由不同濃度咪唑洗脫液的洗脫，雜蛋白含量逐漸減少，目標蛋白的相對含量逐漸增加。兩個目標重組蛋白His（6）-TaATG4a和His（6）-TaATG8h的500 mmol·L-1咪唑洗脫液的純度較高，滿足抗體的制備要求。但洗脫液中目標蛋白的含量較低，因此如果后續免疫工作中抗原量不足，可以選擇其他雜蛋白含量較低的咪唑濃度洗脫液進行切膠后回收目標條帶免疫或碎膠直接免疫的方法。

3 結論與討論

自噬是一種普遍的蛋白質降解途徑，在植物新陳代謝和生長中扮演了重要角色，這些過程包括種子的發育、液泡的增大、饑餓條件下氮的循環、衰老、細胞凋亡和植物在生物、非生物脅迫下的響應[11]，所以從包括ATG4和ATG8在內的重要ATG基因入手，對自噬分子機制開展深入研究具有重要的生物學意義。

本研究采用pET30a大腸桿菌表達系統進行原核表達，該原核表達系統帶有T7噬菌體啟動子，能夠將多聚組氨酸標簽融合入目的蛋白，此方法的優點有易于純化、操作方便和表達量大等[12]。在pET30a表達載體上的T7啟動子能夠與大腸桿菌BL21（DE3）中噬菌體編碼的T7 RNA聚合酶特異性的結合，然后啟動T7啟動子下游的目標基因的表達。T7 RNA聚合酶的活性很高，它的轉錄合成RNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快很多，并且不經常有終止轉錄的現象發生[13]。本研究中通過原核表達載體構建、IPTG誘導表達和基于組氨酸標簽的Ni柱親和層析過程獲得了純化的TaATG4a和TaATG8h重組蛋白。重組蛋白的獲得為今后抗體制備和通過免疫學方法深入研究TaATG4a和TaATG8h基因在小麥自噬過程中的功能奠定了基礎。重組蛋白以可溶性形式存在，這使后續的蛋白純化過程可以在無變性劑的相對溫和條件下進行，純化后的蛋白可以最大限度地保持其空間構象與功能，便于以后的體外酶活分析研究。

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