植物轉基因技術及其應用

摘 要：本文綜述了五種重要的植物遺傳轉化方法（農桿菌介導法，聚乙二醇法，基因槍法，花粉通道法和電激穿孔法）及其應用，并闡述了植物轉基因技術在抗除草劑，抗逆性和品質改良等方面的研究進展。

關鍵詞：轉基因技術；應用；研究進展

Abstract：In this paper，a brief introduction about the principle and application of the five DNA transformation techniques：Agrobacterium-mediated transformation，Polyethylene glycol method，gene gun bombardment，electroporation method and pollen-tube pathway transformation and has been review.Illustrates the progress in the application of plant genetic improvement，including herbicide resistant，stress resistance，quality improvemrnt.

Key words：transgenic technology；application；research review

20世紀70年代末，關于轉基因植物的研究開始出現，當時研究人員利用野生型Ri和Ti質粒對細胞進行轉化，只在一小部分植物（如煙草、馬鈴薯）上成功再生出轉基因植株[1，2]。三十年來，隨著科學家對高等植物組織培養技術和基因重組技術的深入研究以及這些技術的快速發展，植物轉基因技術應運而生。轉基因技術，也被稱為基因工程，植物基因工程是現代植物生物技術的研究核心。它是按照人們的意愿將外源DNA（基因）重組到受體細胞基因組中并使之得到特異性表達。利用植物基因工程能夠克服植物遠緣雜交的不親和障礙，擴大物種雜交的范圍，加快變異速度，提供了定向創造生物的可能性。因此，轉基因技術是改良品種，開發高產、優質、高效兼抗性作物新類型和新品種的重要途徑。

1983年，比利時科學家Montague和美國Fraley等人將新霉素磷酸轉移酶（NPT）基因通過農桿菌Ti質粒載體轉入煙草細胞，得到了抗卡那霉素的煙草愈傷組織，并成功獲得世界上首株抗病毒轉基因煙草，這標志著人類希望通過轉基因技術對植物品質進行改造，將抗除草劑基因、抗病基因、抗蟲基因、抗環境脅迫性狀基因和特殊蛋白基因等有益基因轉化到農作物中，使之獲得所需的優良遺傳性狀成為可能。迄今為止已經成功培育出轉基因煙草，水稻，番茄，棉花，大豆，玉米和矮牽牛等轉基因植物近200種，植物轉基因技術在作物改良和作物育種等研究方面有著至關重要的作用。本文介紹了幾種常用且有效的植物遺傳轉化方法，以及植物轉基因技術的應用和展望。

1 植物轉基因技術的方法

植物轉基因技術根據轉化過程中是否需要載體，可劃分為兩大類：直接導入技術和間接導入技術。直接導入技術即是不依賴其他載體，直接將經過一些特殊處理的裸露DNA導入到植物細胞或原生質體中來實現轉化的。直接導入技術主要采用的方法是化學方法（聚乙二醇介導法）和物理方法（如基因槍法、花粉管通道法、電激穿孔法、顯微注射法以及超聲波導入法等）。間接導入技術主要是將外源基因插入到農桿菌的質粒上或是病毒載體的DNA上，再通過載體將外源基因重組到植物細胞基因組中，其方法主要有農桿菌介導法和植物病毒介導法。目前，農桿菌介導法，基因槍法，聚乙二醇（PEG）介導法，電激穿孔法和花粉管通道法是在植物遺傳轉化中廣泛應用的幾種方法。

1.1 農桿菌介導法

農桿菌介導法是先將插入目的基因的植物表達載體轉入農桿菌中，然后通過農桿菌侵染植物，將根癌農桿菌的Ti質粒或發根農桿菌的Ri質粒上的目的基因導入植物受體細胞并整合到其基因組中，從而完成目的基因的轉化。農桿菌介導法是目前為止應用最早，研究最深入，應用最廣泛，技術相對成熟、有效的轉基因方法。自1983年首次運用農桿菌介導法獲得轉基因植物以來，研究人員相繼利用該方法獲得了番茄，牽牛花和油菜等轉基因植株，迄今全球有超過80%的轉基因植物是利用農桿菌介導法轉化成功的。1985年Horsh等創立了葉盤轉化法，它是利用根癌農桿菌侵染植物外植體（植物組織、幼苗）后與之共培養來實現轉化的轉基因系統，該方法簡單有效，廣泛應用于雙子葉植物的遺傳轉化[3，4]。長期以來農桿菌介導法僅限于雙子葉植物的遺傳轉化，直至近年研究表明，酚類物質（如乙酰丁香酮）可促進農桿菌吸附在植物細胞和幼苗上，以此提高轉化率。因而通過在轉化過程中加入信號傳導物質成為農桿菌介導法在用于單子葉植物的遺傳轉化上的重要突破[5，6]，一些主要單子葉植物如水稻[7]、玉米[8]和大麥[9]均通過農桿菌介導法成功得到了轉基因植株。與其他方法相比，農桿菌介導法有著明顯的優勢[10]，該方法操作簡便，所需費用低，可用于轉化相對較大的DNA片段，能更有效地產生單位點整合，不易產生基因沉默，能夠穩定遺傳，而且轉化率和重復性較好，并能得到可育的轉基因植株。但此方法的缺點是在轉化過程中很難掌握材料的抑菌程度且轉化過程會出現左邊界丟失現象等[11]。

1.2 基因槍法

1987年，美國康奈爾大學生物化學系的Sanford首次提出基因槍法[12]，也稱為粒子槍法、高速微彈法、微彈轟擊法。其原理是用鎢粉或金粉等金屬微粒包裹外源DNA，利用高壓放電或高壓氣體作為驅動力使金屬微粒高速運動擊入受體細胞或組織中，從而將外源目的基因整合到植物基因組中并培育出轉基因植株。同年Klein等首次利用基因法成功得到了轉基因玉米。目前，有很多植物通過基因槍技法轉化成功，如棉花[13]、水稻[14]、玉米[15]、小麥[16]、大豆[17]、土豆[18]等，它對于難再生植物的遺傳轉化更為實用。基因槍方法的優點是操作簡單、轉化時間短、對靶細胞及受體材料來源沒有嚴格要求、還能使外源基因轉化線粒體和葉綠體，使轉化細胞器成為可能[19]。其缺點是轉化植物整合位點不定、拷貝數多、嵌合體多、容易發生共抑制和基因沉默現象、所用儀器昂貴且轉化效率低。

1.3 聚乙二醇介導法

聚乙二醇（PEG）是植物遺傳轉化最常用的化學誘導劑。1980年Dayey等首次建立了聚乙二醇法。它的原理是在高pH條件下的PEG與原生質體融合，原生質體膜的通透性發生改變，加強了原生質對外源DNA的吸收，使目的基因整合到原生質體的基因組上并使之發生特異表達。1982年Krens[20]等進一步發展了這種通過PEG介導轉化原生質體的轉化體系。1988年Zhang等通過聚乙二醇法將GUS基因成功的轉入水稻的原生質體中，并獲得了第一批轉基因水稻。此后，該方法也先后成功轉化了小麥，水稻，高梁，油菜和大豆等植物[20]。聚乙二醇法的優點是對細胞的副作用小，轉化的穩定性、重復性好，并能實現一次轉化多個原生質體，由于轉基因植株來自同一細胞，因而能有效避免嵌合轉化體的產生。它的缺點是轉化率較低（一般為10-5～10-6），因為PEG對原生質體有毒害作用，所以該方法不能用于原生質體培養，也不能用于再生困難的植物。

1.4 花粉管通道法

1983年科學家周光宇通過研究我國遠緣雜交提出了DNA片段雜交的假設[21]，為花粉通道法提供了理論基礎，并首次通過花粉管通道法將海島棉基因轉入陸地棉，并培育出抗枯萎病棉花新品種[22]。花粉管通道法是在植物授粉后的特殊時期，利用在植物開花過程中萌發的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵，進而使目的基因整合到受體植物基因組中，使其自然發育成種子并形成轉基因植株。利用花粉管通道法已成功轉化了棉花、水稻和小麥等農作物[23]，培育出許多有抗逆性和優良品質的新品種。該方法的優點是不需要組培再生過程，操作技術簡單，對外源基因、受體植物種類和儀器設備要求不高，育種周期短。缺點是在轉化過程中容易受植物本身和外界影響、轉化效率低、可重復性差。

1.5 電激穿孔法

電激穿孔法的原理是當植物細胞受到外界高壓電擊時，細胞膜會出現非對稱穿孔，但這種開放小孔的出現是具有可逆性，解除電擊后這些小孔會關閉，所以在此期間要利用這種小孔成為外源基因導入細胞的通道，從而使目的基因導入并整合到受體細胞的基因組上。1985年Michael等人首次利用電激穿孔法，在1400 V的高壓條件下處理細胞質膜，使外源基因導入，在培養2～4天后的原生質體中檢測到外源基因的瞬時表達[25]。此后，電激穿孔法相繼成功的應用于煙草、番茄、玉米、水稻、大豆、小麥和馬鈴薯等植物原生質體的轉化。該方法優點是對受體材料來源廣泛，操作簡便。缺點是轉化率低。

2 植物轉基因技術的應用

通過基因工程技術來改變植物基因特性，可以培育出人類需要的具有抗除草劑、抗蟲害、抗病或者抗寒、抗旱、抗鹽堿等具有優良品質的植物新品種和新品系。1986年首次批準轉基因作物進入田間試驗，之后近三十年里轉基因作物研究迅速發展，直至今天全球有30個國家被批準種植轉基因作物，種植總面積達到1.7億hm2，植物種植類達40余種。轉基因技術在全球迅速發展的同時，在我國也得到較快的發展。我國在棉花、水稻、玉米、大豆和小麥等作物轉基因的研究上獲得了可喜的成果。

2.1 抗除草劑

目前，抗除草劑植物的種植面積約占轉基因植物種植總面積的59%，是全球種植面積最大的一類轉基因植物[26]。抗除草劑的種類主要有草銨膦、草甘膦、2，4-D，咪唑啉酮和磺酰脲類。高濃度的2，4-D也是一種有效除草劑，1994年我國獲得的第一株轉基因抗除草劑棉花就是通過2，4-D單氧化酶基因導入棉花中，并獲得可遺傳植株。1994年，由抗溴苯腈作為選擇標記基因的轉基因棉花開始用于種植。1996年到1998年，抗草甘膦的轉基因大豆，棉花，玉米以及抗草銨膦的油菜，棉花，玉米也陸續進入大面積種植。抗除草劑植物的廣泛種植，有效的節約了勞動力，大幅度提高了農業生產效率。

2.2 抗逆性

植物生長過程中會遇到很多的生物非生物脅迫，主要有蟲害，病害，干旱，鹽堿和極端溫度等。因此我們要通過轉基因技術來提高植物的抗逆水平。

最早應用的抗蟲基因是蘇云金桿菌毒蛋白基因（Bt）。1987年比利時科學家將Bt基因轉入煙草細胞，獲得抗蟲轉基因煙草。同年，我國利用農桿菌介導法，首次將Bt基因轉入番茄和煙草中，并成功得到相應的可遺傳的抗蟲轉基因植株。此后又成功的將Bt基因相繼轉入玉米、茄子和棉花等植物。Bt轉基因植物的細菌內毒素只是對特定的害蟲（鱗翅目昆蟲）有較高的毒害作用，對人和非目標昆蟲幾乎沒有毒性[27]，但Bt基因的抗蟲譜較窄，昆蟲對其容易產生耐受性。目前除了Bt基因，常用的抗蟲基因還有蛋白酶抑制劑基因（PI）、淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因、蝎毒素基因和蜘蛛素基因等。

目前抗病轉基因植物的種植面積遠遠低于抗除草劑和抗蟲轉基因植物的種植面積[28]。它主要是通過向植物中轉入抗菌肽、幾丁質酶和防御素來提高植物的抗病能力。基因抗病毒轉基因的分子機制主要有抑制病毒增殖，阻止病毒移動，RNA沉默介導三種機制。最常用、有效的方法就是利用RNA沉默介導實現植物的抗病能力的提高，利用該方法成功獲得了具有明顯抗病性的玉米[29]、大豆[30]、番茄[31]和大麥[32]等轉基因植物。

除了以上的抗性轉基因研究外，在抗寒、抗旱和耐鹽堿等抗環境脅迫方面的轉基因研究也有很大進展。目前，已有報道將抗凍蛋白、熱擊蛋白成功轉入玉米[33]、煙草[34]和番茄[35，36]中，獲得相應的抗寒轉基因植物，提高了它們的抗寒能力。通過向玉米中轉入6-磷酸海藻合成酶基因，來提高玉米的抗旱能力。也有研究表明，利用甜菜堿醛脫氫酶基因轉化馬鈴薯[37]，花生、[38]、棉花[39]、胡蘿

卜[40]，轉基因植株仍能在NaCl脅迫條件下生長良好。

2.3 品質改良方面

利用轉基因技術進行品質改良主要目的是提高作物產品質量和營養價值。目前應用于作物產品質量改良的基因主要有：控制果實成熟的基因、谷物種子貯藏蛋白基因、控制脂肪合成基因等。我國研究人員已成功將高賴氨酸基因整合到玉米基因組上，獲得轉基因植株中賴氨酸含量提高了10%以上。獲得的延熟轉基因番茄的儲藏時間通常延長1～2個月，最高延熟時間甚至超過80天[41]。瑞士Potrykus等將類胡蘿卜素的相關合成基因成功轉入水稻，培育出有類胡蘿卜素的水稻，提高其營養價值。

3 植物轉基因技術的應用前景

植物轉基因技術是以分子生物學為研究手段，對目的基因進行人工分離、修飾和轉移，通過導入基因再表達，來賦予植物新的優良性狀從而選育出新品種。利用植物轉基因技術來改造植物，可增強植物的抗逆性，有效防止病蟲害的發生，減少化學殺蟲劑和除草劑的使用，降低了生產成本，減少環境污染，降低對其他生物的傷害，同時可以減少占用耕地面積并改善了土地的生產能力。研發生物技術、開發轉基因作物，是提高農產品供應和維護糧食安全可能的重要途徑之一。植物轉基因技術將帶來現代農業的一次革命，作為世界第一人口大國，中國不能拒絕生物技術和轉基因作物，加強對轉基因植物的研究和發展是我們的必然選擇。

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