復蘇溫度對BHK—21細胞活力的影響

李培林++郭海平++哈申高娃++郭冠萍++趙子紅

摘要：分別用幾組不同溫度（37、38、39、40、41、42 ℃）的水浴來復蘇BHK-21細胞，研究不同溫度對BHK-21細胞的影響。結果表明，在溫度為38、39 ℃時，復蘇細胞的平均活力分別為99.8%、99.6%，說明了復蘇溫度與活力的相關性。

關鍵詞：BHK-21細胞；復蘇；細胞活力

中圖分類號：Q813.11 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2015）06-0010-02

動物細胞大規模培養技術是指在人工條件下，高密度、大規模培養動物細胞生產生物技術產品，生產中為了使細胞的生長狀態更加良好，并且能夠穩定傳代同時避免污染或發生細胞變異，因此，需要一種快速有效的復蘇手段去復蘇細胞。復蘇就是以一定的復溫速度將體外的培養物或生物活性物質恢復到常溫下的過程，不論是微生物、動物細胞、植物細胞，還是體外培養的器官都可以進行凍存，并在適當的溫度下復蘇。細胞復蘇的溫度一般是在37～42 ℃，不同溫度的水浴對復蘇BHK-21細胞活力有著一定的影響，本試驗就此進行了復蘇溫度和活力相關性的分析研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 連續傳代的常規培養基培養的BHK-21細胞，按《BHK-21細胞凍存規程》凍存F68代細胞，由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

1.1.2 培養基 45%的乳漢液（本公司自配），45%的MEM（北京清大天一生物技術有限公司），10%的犢牛血清（山西太原生物技術有限公司）。

1.1.3 儀器設備 液氮罐（YDS-30-125F）購自山樂山市東亞機電工貿有限公司，倒置顯微鏡（CKX41）OLYMPUS，T75小方瓶，水浴，小離心管。超凈工作臺（XJ-1450）購自上海安亭科學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 常規培養基配制 將45%的乳漢液和45%的MEM混合均勻，加入10%的犢牛血清，再加入1%的碳酸氫鈉，1%的雙抗，0.5%的谷氨酰胺，分別倒入6個T75的方瓶中，每瓶30 mL，備用。

1.2.2 BHK-21細胞的復蘇 ①調配37～42 ℃的溫水。②從液氮中取出凍存管，立刻投入37～42 ℃的溫水中迅速晃動，直至凍存液完全溶解。③將細胞凍存液轉移到離心管內，加入5 mL的培養液，輕輕吹打混勻。④將細胞液經720 r/min離心，棄去上清液。⑤向細胞沉淀內加入培養液，輕輕吹打混勻，將細胞懸液移到培養瓶內，補足培養液進行培養。

1.2.3 細胞計數 按《細胞培養基技術手冊》（北京清大天一公司）介紹的方法進行計數：①將細胞計數板擦拭干凈，蓋玻片用無水乙醇預先浸泡后擦拭干凈，蓋于計數室上方。②取1 mL的臺盼藍放入小離心管內，取1 mL細胞液也放入此離心管內，吹打均勻，染色數分鐘。③將已染好的細胞液吸出，沿蓋玻片邊緣自然滲入，使懸液充滿蓋玻片和計數板之間，不要留有氣泡，也不要外溢。④靜置，顯微鏡下觀察計數板四角大方格中細胞數。細胞壓中線時，一般遵循“計上不計下，計左不計右”的原則。將計數結果按以下公式計算：

細胞活力=（細胞總數-活細胞數）/細胞總數×100%

2 結果與分析

從表1中可以看出，細胞在38、39 ℃下的細胞平均活力為99.8%和99.6%，明顯高于其他四組水溫下的細胞平均活力，說明38、39 ℃的水溫是復蘇細胞的最佳溫度。從圖1中可知，復蘇水溫在38、39 ℃時，曲線相對平穩，細胞的活力相對穩定，而且活力明顯要高。其他幾組曲線起伏波動較大，而且活力較低。因此可見，復蘇細胞時，水溫控制在38、39 ℃時，細胞活力較高。

3 小結與討論

（1）在細胞復蘇時，一般以很快的速度升溫，1～2 min即可恢復到常溫下，細胞內不會重新形成較大結晶，也不會暴露在高濃度的電解質溶液中過長時間，從而無結晶損傷和溶質損傷，凍存的細胞經復蘇后仍保持其正常的結構和功能。細胞凍存懸液一旦溶解后，要盡快去除凍存保護液，防止凍存保護液對細胞產生毒性。

（2）在細胞復蘇時，水溫應該控制在38 、39 ℃下時細胞活力較高，細胞活力的高低是衡量細胞生命力的重要標志，也極大程度上影響著以后細胞的增殖，細胞的增殖是活細胞的重要生理功能，也是生物體的重要生命特征之一，是生物體生長發育，繁殖及遺傳的基礎。