HPLC法對冬蟲夏草和蛹蟲草中核苷酸類成分的分析

何帥

（臨清市食品藥品監督管理局 山東 臨清 252600）

摘要：采用反相高效液相色譜法，以SHIMADZU C18（150mm×4.6mm I.D. ，5μm）為色譜柱；以緩沖鹽（KH2PO4-H3PO4）-甲醇（99.5：0.5）（pH3.75）體系為流動相，在流速0.8mL/min，柱溫26°C，檢測波長260nm，進樣量20μL的條件下對上述兩個樣品中5′-核苷酸的含量進行了分析測定。結論該法快速簡便，重現性好，能有效的測定樣品中核苷酸類成分。

關鍵詞：5′-核苷酸；冬蟲夏草；蛹蟲草菌絲體；高效液相色譜

【中圖分類號】R914.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1002-

3763（2014）02-0003-01

核酸是生命科學中重要的復雜的生物大分子。核酸組成的分析促進了生物化學的迅速發展，因此越來越引起人們的重視。現代藥理研究表明，冬蟲夏草及其活性成分對免疫系統有雙向調節作用，對腎臟和肝臟疾病有治療作用，并有抗腫瘤、抗衰老和抗應激的活性[1]。蛹蟲草是一種與冬蟲夏草藥理作用相近的藥材，具有增強機體免疫力及抑制腫瘤生長的作用。在含量上有些成分含量高于冬蟲夏草。

本文主要測定冬蟲夏草、蛹蟲草菌絲體中的5′-核苷酸。應用反相高效液相色譜系統測定上述兩種樣品中的核苷酸類物質。

1材料與方法

色譜甲醇（山東禹王試劑廠）、磷酸鹽緩沖液（pH=3.75，濃度0.2mol？L-1）、超純水；對照品5′-AMP（5′-腺苷酸）、5′-CMP（5′-胞苷酸）、5′-GMP（5′-鳥苷酸）、5′-UMP（5′-尿苷酸）、5′-IMP（5′-嘌呤核苷酸）、5′-XMP（5′-黃嘌呤核苷酸）均購自中國藥品生物制品檢定所。

分別取6種標準品，精密稱定后，置于容量瓶，定容，然后稀釋成一定濃度的對照品溶液。

混合標準品的配制：5′-UMP、5′-GMP、5′-AMP、5′-CMP、5′-IMP、5′-XMP濃度分別為0.0210，0.0152，0.0152，0.0160，0.0260和0.0194g·L-1。

安捷倫高效液相色譜儀（Agilent 1100 HPLC， America）；色譜柱：SHIMADZU C18（150mm×4.6mm I.D.， 5μm）；流動相：緩沖鹽（KH2PO4-H3PO4）-甲醇（99.5：0.5）（pH3.75）體系；流速：0.8mL/min；柱溫：26℃；檢測波長：260nm；進樣量：20μL。

樣品：冬蟲夏草（購自西藏自治區藥材公司）；蛹蟲草菌絲體（北京大學生命學院菌種室提供）。

樣品的制備：分別稱取上述四種樣品各0.500g，加10mL水，超聲粉碎，在4200r·min-1下離心20min。取上清液，用0.45μm濾膜過濾。

超聲粉碎條件：JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機，超聲5s鐘，間歇5s，工作60次，重復1次，共計20 min。

用標準加入法對對照品中各色譜組分進行色譜分析，六種組分依次為： 5′-CMP；5′-UMP；5′-GMP；5′-IMP；5′-XMP；5′-AMP。

2 方法學考察

精密吸取混合標準溶液2，4，6，8和10mL，分別置于50mL量瓶中，用超純水定容。在上述色譜條件下進樣20μL，測定峰面積，以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，由標準曲線可知：六種對照品分別在8.2～42.2，6.0～31.5，5.8～30.9，6.2～33.0，7.1～38.4和7.5～41.5mg·L-1范圍內具有良好的線性關系，經日內兩次重復，相關系數均在0.998以上。

表明此標準混合工作液，在冷藏的條件下，至少4日內其濃度基本不變。

稱對照品一份，按上述方法制備供試液，于相同色譜條件及進樣量下測定峰面積，一日內每4h測定1次，連續測定5次。將每個對照品當日測定的5次的峰面積的平均值，及各次的峰面積積分結果進行統計，RSD分別為2.34%，2.51%，2.48%，2.08%，2.10%和2.02%（n=5）。

稱取對照品5份，每份0.1g，按對照品制備方法制備供試液，分別在相同色譜條件和進樣量下測定峰面積，將每個對照品測定的5次的峰面積的平均值，及各次的峰面積積分結果進行統計， RSD分別為2.09%，2.23%，2.10%，2.52%，2.05%和2.11%（n=5）。

結果表明樣品供試品溶液在8h內基本穩定。

2.1冬蟲夏草

取約0.25g已知含量的樣品，精密稱定。精密加入已知量的對照品適量，按樣品條件進樣測定。

取已經處理好的樣品于高效液相色譜儀配備的樣品瓶中，按最佳色譜條件進樣。

用標準加入法對各核苷酸類組分進行定性，然后用標準曲線法計算樣品中所含各種核苷酸的含量分別為：5′-UMP 886.0μg·g-1、5′-GMP 11.1μg·g-1、5′-IMP 1640.4μg·g-1、 5′-AMP 153.7μg·g-1。

2.2蛹蟲草菌絲體

取約0.25g已知含量的樣品，精密稱定。精密加入已知量的對照品適量，按樣品條件進樣測定。

用標準加入法對各核苷酸類組分進行定性，用標準曲線法計算樣品中所含各種核苷酸的含量分別為：

5′-CMP 173.0μg·g-1、 5′-UMP 824.9μg·g-1、5′-GMP 92.9μg·g-1、5′-IMP 2114.0μg·g-1、5′-XMP 79.6μg·g-1、5′-AMP 231.4μg·g-1。

3 結論

經測定冬蟲夏草有4種核苷酸，每克含量為：5′-UMP 886.0μg、5′-GMP 11.1μg、5′-IMP 1640.4μg、 5′-AMP 153.7μg ；蛹蟲草菌絲體有6種核苷酸，每克含量為：5′-CMP 173.0μg、 5′-UMP 824.9μg、5′-GMP 92.9μg、5′-IMP 2114.0 μg、5′-XMP 79.6 μg、5′-AMP231.4 μg 。

冬蟲夏草和蛹蟲草菌絲體中5′-UMP 、5′-IMP 含量均較高。

本文用反相高效液相色譜法對兩種樣品中的核苷酸類物質進行定性、定量分析，快速、簡便、重現性好，為進一步開發利用蟲草等珍貴藥材提供了理論數據。

參考文獻：

[1]郭海平，楊智敏.冬蟲夏草藥理作用研究進展[J].中草藥，1999，30（3）：231-233.