拉米夫定耐藥感染者HBV基因與YMDD變異的相關性探討

張志珊，蔣燕成，吳福林，王文杰，張 璇，林慧英，林毅勝＊

（1.福建醫科大學附屬泉州第一醫院 檢驗科，泉州362000；2.泉州市中心血站，泉州362000）

拉米夫定是新一代抗病毒核苷類似物，它能有效地抑制乙型肝炎病毒（HBV）復制，從而迅速降低血清HBV DNA水平。但長期使用容易使HBV P基因區的酪氨酸－蛋氨酸－天門冬氨酸－天門冬氨酸（YMDD）片段發生突變，使患者對拉米夫定產生耐藥，導致治療失敗。目前，根據乙型肝炎病毒（HBV）全基因組序列差異≥8%，或S基因序列≥4%，將HBV分為A－H 8個基因型。不同的基因型與病毒復制及致病性、宿主免疫應答和臨床表現、治療與預后等都有一定的相關性。本文通過對拉米夫定治療后無良好應答的慢性乙型肝炎感染者進行HBV基因型的測定，探討HBV耐藥株YMDD變異與基因型的相關性。

1 材料與方法

1.1 病例資料 2009年1月至2010年12月于本院接受抗病毒治療后無良好應答的慢性乙型肝炎（CHB）患者162例，其中男126例，女36例，年齡20－62歲，平均31.3±10.8歲。診斷符合2000年修訂的《病毒性肝炎防治方案》[1]的診斷標準。所有的患者均排除甲、丙、丁、戊型肝炎感染。所有血清置于－70℃保存。拉米夫定無良好應答者是指口服拉米夫定100mg／d，治療6個月后病毒載量下降小于2lg IU／ml、病毒載量不降或反彈[2]。

1.2 試劑和儀器 核酸提取試劑由達安基因有限公司提供，Taq酶、dNTP為Takara公司產品，引物由上海生物工程有限公司合成，PCR擴增儀為eppendorf產品。HBV DNA熒光定量檢測試劑盒為達安基因有限公司產品，YMDD變異檢測試劑盒為上海復興公司產品，采用美國貝克曼全自動生化分析儀檢測ALT水平。實時熒光定量PCR儀ABI 7300為美國PE公司產品。

1.3 方法

1.3.1 HBV基因型的鑒定（1）核酸的提取：取血清50μl，加入50μl裂解液，100℃保溫10分鐘，13 000 rpm離心5分鐘，上清即為HBV DNA。（2）DNA的擴增：采用套式PCR法對病毒S基因進行擴增。外 側 引 物：5’－CCTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTC－3 ’ （nt22－77 ）， 5 ’－GGCGGCAAACCCCAAAAGACCC－3’（nt1004－1025）；內側引物：5 ’－CTAG GACCCCTGCTCGTGTTACA－3 ’（nt181－203），5’－ATTACATATCCCATGAAGTTA AG－3’（nt870－892）。擴增條件：94℃ 5min，94℃30sec，55℃30sec，72℃60sec共35cycles循環，72℃5min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送上海生物工程有限公司進行測序。（3）基因型鑒定：應用 Mega軟件中 NJ（Neighbor－Joining）法進行系統進化樹的構建并分析基因型。

1.3.2 HBV DNA 載量、YMDD變異、ALT 水平的檢測 參照說明書進行。

1.3.3 統計學方法 用SPSS10.0統計學軟件采用χ2檢驗和t檢驗法進行統計學分析。

2 結果

2.1 HBV基因型分布情況 162例對拉米夫定治療后無良好應答的CHB感染者中，B基因型102例（63.0%），C基因型60例 （37.0%）。126 例 男 性HBV感染者中，B、C型的比例分別為64.2%（81／126）和35.8%（45／126）；36例女性感染者中，B、C型的比例分別為58.3%（21／36）和41.7%（15／36）。男女人群中，HBV基因型分布沒有顯著性差別（P＞0.05）。B型患者的年齡（29.7歲±10.2歲）明顯低于C型患者的年齡（35.3歲±11.3歲），差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 B、C型HBV感染者HBV DNA、ALT水平差異 C基因型CHB患者血清的HBV DNA含量顯著高于B基因型（P＜0.05），而血清ALT水平沒有顯著性差別（P＞0.05），見表1。

表1 HBV B、C基因型患者血清HBV DNA、ALT水平差異

2.3 YMDD變異率及變異類型162例患者中，YMDD野生型51例（31.5%），發生YMDD變異的有 111 例 （68.5%），其 中 YIDD 變 異 30 例（18.5%），YVDD 變 異 32 例 （19.7%），YIDD／YVDD混合型變異49例（30.3%）。

2.4 CHB患者YMDD變異與基因型的關系 B基因型患者YMDD變異率為72.5%，C基因型患者YMDD變異率為61.7%，差異無統計學意義（P＞0.05）。B、C基因型患者YMDD 變異類型分布差異也無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 HBV B、C基因型患者YMDD變異情況[n（%）]

3 討論

大量研究表明，HBV的基因型分布具有明顯的地域性，不同的基因型具有其獨特的流行病學特點和分子生物學特征，與乙型肝炎病毒復制及致病性、宿主免疫應答和臨床表現、治療與預后等都有一定的相關性。我國北方以C基因型為主，南方以B基因型為主，由北向南B型逐漸增多，而C型逐漸減少[3]。本結果顯示，拉米夫定抗病毒治療后無良好應答者的CHB患者B型占63.0%，C型占37.0%，本次調查中未發現其它型別的基因型，符合本地區HBV基因型的分布特點。不同性別患者基因型的分布沒有顯著差異，但是B基因型患者的年齡顯著低于C基因型患者（P＜0.05）。

拉米夫定是臨床上應用最為廣泛的核苷類抗病毒藥物，臨床試驗表明，拉米夫定（100mg／d）可有效地抑制HBV DNA的復制，同時伴有ALT正常，改善肝組織病變。但長期應用后可誘發HBV P區變異，從而產生耐藥。YMDD變異有兩種類型，分別是HBV P基因C區第739位堿基A→G和741位G→T突變而引起，從而導致第552位蛋氨酸（M）被纈氨酸（V）或異亮氨酸（I）所取代，變成 M552V與M552I，即YVDD和YIDD變異。本研究結果顯示，拉米夫定抗病毒治療后無良好應答者的CHB患者，YMDD變異率達到68.5%，其中YIDD／YVDD混合型變異占44.1%（49／111），YIDD 變異與 YVDD變異分別為27.0%（30／111）和28.9%（32／111）。

目前對于拉米夫定耐藥與HBV基因型的相關性尚無定論，譚文婷[4]等人認為不同基因型患者拉米夫定治療后YMDD變異率沒有相關性[5]。周建良等[5]則報道，B基因型YMDD變異的發生率低于C型，并認為基因型是誘導變異的重要因素之一。Pan等[6]研究顯示 HBV YMDD變異與基因型無關。本研究結果顯示，對拉米夫定無良好應答的CHB患者B、C基因型間YMDD變異率無明顯差別（P＞0.05），B、C基因型間 ALT水平也沒有明顯差別（P＞0.05），但C基因型患者血清的 HBV DNA含量顯著高于B基因型組（P＜0.05）。Yuen[7]等研究結果顯示，B基因型的HBV能活化Th1細胞且抑制Th2細胞，而C基因型則相反，提示B基因型的HBV更能誘發人體的免疫反應，這可能是B基因型病毒載量較C基因型低的原因。

拉米夫定抗病毒治療后無良好應答者的CHB患者中，YMDD變異是導致耐藥的關鍵因素，雖然B、C基因與YMDD變異沒有明顯的相關性，但C基因型患者血清的HBV DNA含量顯著高于B基因型組，可能也是導致CHB患者對拉米夫定無良好應答的原因之一。此外，年齡、免疫因素、YMDD以外其他位點的突變可能也是影響拉米夫定療效的重要因素。

[1]中華醫學會傳染病與寄生蟲病分會、肝病分會.病毒性肝炎防治方案[J].中華肝臟病雜志，2000，8：324.

[2]Lok AS，McMahon BJ.Chronic hepatitis B[J].Hepatology，2007，45：507.

[3]張愛民，王慧芬，王海濱，等.中國30個地區HBV基因型分布特點和臨床意義[J].中華實驗和臨床病毒學雜志，2011，25（2）：126.

[4]譚文婷，鄧國宏，王宇明，等.乙型肝炎病毒基因型對拉米夫定抗病毒療效的影響[J].中華肝臟病雜志，2008，6（7）：540.

[5]周建良，吳詩品.慢性乙型肝炎病毒基因型與拉米夫定療效關系的研究[J].中西醫結合肝病雜志，2003，13（6）：332.

[6]Pan XP，Li LJ，Du WB，et al.Differences of YMDD mutational patterns，precore／core promoter mutations，serum HBV DNA levels in lamivudine－resistant hepatitis B genotypes B and C[J].J Viral Hepat，2007，14（11）：767.

[7]Yuen MF，Wong DK，Zheng BJ，et al.Difference in T helper response during hepatitis flares in hepatitis B antigen （HbeAg）－positive patients with genotypes B and C：implication for early HbeAg seroconversion[J].J Viral Hepat，2007，14：269.