量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)在食源性病原體檢測(cè)中的研究進(jìn)展

金瑩 房保海 姜英輝等

摘要近年來(lái)，量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)得到較快發(fā)展，以其為基礎(chǔ)開發(fā)的檢測(cè)技術(shù)在食品安全檢測(cè)方面已有廣泛應(yīng)用。為了解量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)在食源性病原體檢測(cè)中的應(yīng)用研究現(xiàn)狀，為量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)在食品安全檢測(cè)中進(jìn)一步深入推廣，簡(jiǎn)要綜述了量子點(diǎn)的生物相容性及其在食源性病原體檢測(cè)方面的研究進(jìn)展和應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞量子點(diǎn)標(biāo)記；食源性病原體；檢測(cè)

中圖分類號(hào)R184.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）01-00245-03

基金項(xiàng)目國(guó)家質(zhì)檢總局項(xiàng)目“基于量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)研究”（2011IK221）。

作者簡(jiǎn)介金瑩（1981- ），女，山東沂水人，農(nóng)藝師，博士，從事食品安全研究，Email：jiny81@163.com。*通訊作者，博士，從事食品安全與檢測(cè)研究。

收稿日期20131210量子點(diǎn)（QDs）又稱為半導(dǎo)體納米微晶粒，是一種由Ⅱ～Ⅵ 族元素（如 CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等）或III～V族元素（如InP、InAs等）組成，直徑在1～100 nm的納米顆粒，目前研究較多的主要是 CdX（X = S、Se、Te）[1-2]。量子點(diǎn)材料早期多應(yīng)用于物理、電子和材料工程領(lǐng)域，1998年美國(guó)加州伯克利大學(xué)的Alivisatos 小組和印地安納大學(xué)Nie小組幾乎同時(shí)提出熒光量子點(diǎn)可應(yīng)用于生物標(biāo)記這一觀點(diǎn)，開創(chuàng)了熒光量子點(diǎn)在生物技術(shù)中研究應(yīng)用的先河。隨后，量子點(diǎn)技術(shù)在生命科學(xué)、分析科學(xué)、材料科學(xué)、免疫醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)檢疫科學(xué)等傳統(tǒng)及新興的領(lǐng)域中都得到了廣泛的應(yīng)用。

食源性致病菌引起的食源性疾病是引起食品安全的最大隱患之一，越來(lái)越受到各國(guó)的重視，而目前已報(bào)道的食源性致病菌檢測(cè)方法都各有其缺陷，為了適應(yīng)檢測(cè)需要，不斷研究發(fā)展靈敏度更高、普遍適用性更好、更為快速簡(jiǎn)便的新型檢測(cè)方法就顯得非常有意義。筆者重點(diǎn)綜述了量子點(diǎn)的特性及其在食源性病原體檢測(cè)中的研究進(jìn)展，并對(duì)其在今后食品安全檢測(cè)方面的發(fā)展前景予以展望。

1量子點(diǎn)的生物相容性

生物相容性是指材料與生物體之間相互作用后產(chǎn)生的各種生物、物理、化學(xué)等反應(yīng)。即是指材料植入人體后與人體相容程度，是否會(huì)對(duì)人體組織造成毒害作用。這一概念可以從以下3個(gè)方面來(lái)解釋[3]：一是該材料不僅是簡(jiǎn)單地存在于生物體內(nèi)，而必須扮演某一角色；二是該材料對(duì)生物體給予的某些反應(yīng)應(yīng)該產(chǎn)生回應(yīng)；三是該材料必須具有普遍適用性。生物相容性包括兩大原則[4]：一是生物安全性原則，即生物材料對(duì)人體無(wú)破壞性；二是生物功能性原則（或稱為機(jī)體功能的促進(jìn)作用），指材料在特殊的環(huán)境中能夠激發(fā)生物體恰當(dāng)應(yīng)答的能力。

1.1量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性量子點(diǎn)種類繁多，組成成分不同，因此每種量子點(diǎn)的毒性也不同。目前主要從量子點(diǎn)的暴露途徑（職業(yè)暴露或自主暴露等）、暴露濃度、量子點(diǎn)的種類、表面修飾試劑的類型和環(huán)境因素等方面來(lái)研究量子點(diǎn)的毒性[5]。

Derfus等以裸露的CdS量子點(diǎn)和表面帶有修飾試劑（巰基乙酸和半胱胺酸）的CdS量子點(diǎn)對(duì)人胚肝細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記[6]。試驗(yàn)結(jié)果表明，裸露的CdS量子點(diǎn)在人胚肝細(xì)胞中Cd2+的釋放率遠(yuǎn)高于表面帶有修飾試劑的CdS量子點(diǎn)的釋放率，約為15%～25%，從而對(duì)生物體產(chǎn)生毒害作用。其原因可能是Cd2+在細(xì)胞外抑制細(xì)胞的增殖存活能力，或者是細(xì)胞通過吞食作用使量子點(diǎn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，此時(shí)Cd2+與細(xì)胞直接接觸，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損害作用。

Lovric等研究了CdTe量子點(diǎn)的粒徑和濃度對(duì)PCl2和Ng細(xì)胞的影響[7]。結(jié)果表明，量子點(diǎn)的大小決定了其在細(xì)胞中的分布。細(xì)胞質(zhì)中以大粒徑的CdTe量子點(diǎn)為主，而細(xì)胞核中以小粒徑的CdTe量子點(diǎn)為主；當(dāng)不同粒徑的量子點(diǎn)在相同濃度下，小粒徑和大粒徑的量子點(diǎn)對(duì)細(xì)胞代謝活性的抑制率分別為（46.8±2.3）%和（68.8±1.4）%，表明小粒徑量子點(diǎn)的毒性較大。另外，量子點(diǎn)所帶電荷不同，對(duì)細(xì)胞的破壞程度也不相同。

su等比較了K562細(xì)胞在CdTe、CdTe@CdS、CdTe@CdS@ZnS 3種水溶性量子點(diǎn)存在下的細(xì)胞毒性[8]。研究發(fā)現(xiàn)，由于量子點(diǎn)中Cd2+的釋放致使CdTe和CdTe@CdS對(duì)細(xì)胞的毒性較大；而高濃度CdTe@CdS@ZnS量子點(diǎn)長(zhǎng)時(shí)間與細(xì)胞作用，對(duì)細(xì)胞的毒性小于前2種量子點(diǎn)，這可能是由于最外層ZnS的存在阻礙了Cd2+的釋放。這進(jìn)一步說(shuō)明了量子點(diǎn)的結(jié)構(gòu)不同，對(duì)細(xì)胞的毒害作用也不同。

1.2量子點(diǎn)的氧化及降解Derfus等考察了MAATOPOcapped CdSe QDs 對(duì)鼠肝細(xì)胞的影響[6]。量子點(diǎn)表面的修飾試劑由于光解和氧化作用而發(fā)生降解，從而使鼠肝細(xì)胞死亡。肝細(xì)胞毒性與量子點(diǎn)周圍的環(huán)境和濃度有關(guān)，先將MAATOPOcapped CdSe QDs 暴露在空氣或紫外燈下，然后讓其與鼠肝細(xì)胞相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞活性顯著降低。這可能是由于在氧化和光解條件下引起了MAATOPOcapped CdSe QDs 的分解，使游離Cd2+濃度增加而引起的。

Chen等將二氧化硅包覆的CdSe@ZnS量子點(diǎn)與肽偶聯(lián)用來(lái)研究活體細(xì)胞成像[9]。當(dāng)量子點(diǎn)與細(xì)胞的量為比為100∶1006、10∶106 和1∶106時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)該量子點(diǎn)對(duì)Hela細(xì)胞的存活影響較小。這表明硅殼可以有效地阻止Cd、Se、Zn和S 與細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)和DNA之間發(fā)生相互作用。

1.3量子點(diǎn)修飾試劑對(duì)細(xì)胞毒性的影響Hoshino等通過MTT 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在WTKI細(xì)胞內(nèi)以巰基十一酸（MUA）、L半胱氨酸（LCys）和硫代甘油（MPP）修飾的CdSe@ZnS量子點(diǎn)，由于表面修飾試劑的氧化或在體內(nèi)酸性條件下脫落而釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[10]。將WTKI細(xì)胞與MUA capped CdSe @ZnS QDs或LCyscapped CdSe @ZnS QDs 或MPPcapped CdSe @ZnS QDs培養(yǎng)12 h，量子點(diǎn)劑量大于100 μg/ml時(shí)，MUA capped CdSe @ZnS QDs和LCyscapped CdSe @ZnS QDs 均會(huì)表現(xiàn)出嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，而MPPcapped CdSe @ZnS QDs 的毒性幾乎可以忽略。而DNA與量子點(diǎn)（>50 μg/ml）培養(yǎng)2 h便可觀察到DNA的損傷。

2量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)在食源性病原體檢測(cè)中的研究成果

2.1量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)在細(xì)菌污染檢測(cè)中的研究應(yīng)用量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)既可準(zhǔn)確檢測(cè)出食品中致病微生物種類，也可進(jìn)行定量分析，從而大幅提高食品安全性。

繆婷婷等于2010年將納米探針技術(shù)與熒光分析方法結(jié)合應(yīng)用于DNA雜交分析，以沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌特定序列DNA為模式分析物，建立了超微量新型分析方法體系[11]。同時(shí)將其作為發(fā)光成像標(biāo)記物，對(duì)小鼠不同生理狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞成像進(jìn)行了觀察分析，進(jìn)一步拓寬了量子點(diǎn)的應(yīng)用。在試驗(yàn)最佳條件下，沙門氏菌目標(biāo)DNA檢出限為20 fmol/L，李斯特菌目標(biāo)DNA檢出限為25 fmol/L，金黃色葡萄球菌目標(biāo)DNA檢出限為22 fmol/L。

Tully等利用量子點(diǎn)標(biāo)記抗體，通過熒光免疫法測(cè)定單增李斯特菌表面結(jié)合蛋白來(lái)檢測(cè)單增李斯特菌[12]。Hahn等利用親合素標(biāo)記CdSe/ZnS核殼型量子點(diǎn)檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7，檢測(cè)限可達(dá)2.08×107 CFU/ml[13]。

鄒明強(qiáng)等結(jié)合免疫技術(shù)和量子點(diǎn)磁性分離技術(shù)，采用便攜式光譜儀定量測(cè)定大腸桿菌O157：H7，檢出限比普通異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記低100倍，分析在2 h內(nèi)完成[14]。

Wang等利用免疫磁性分離技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)液中單增李斯特菌，首先偶聯(lián)鏈霉親和素的磁性納米珠與含單增李斯特菌的培養(yǎng)液混合，磁性分離后與偶聯(lián)量子點(diǎn)混合，通過測(cè)定磁性納米珠-單增李斯特菌-量子點(diǎn)結(jié)合物的熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)液中單增李斯特菌，檢測(cè)線性范圍100～107 CFU/ml，檢測(cè)限低達(dá)2～3 CFU/ml，檢測(cè)時(shí)間為1.5 h[15]。

此外，利用不同顏色熒光量子點(diǎn)標(biāo)記不同致病微生物抗體，可同步檢測(cè)食品中多種致病微生物。Xue等利用水溶性量子點(diǎn)標(biāo)記大腸桿菌E.coli和金黃色葡萄球菌S.aureus，檢測(cè)范圍為102～107 CFU/ml，檢測(cè)時(shí)間為1～2 h[16]。Yang等利用525、705 nm量子點(diǎn)分別標(biāo)記大腸桿菌E.coli O157∶H7和傷寒沙門氏菌S.Dphimurium抗體，偶聯(lián)抗體的免疫磁珠預(yù)處理分離后，免疫磁珠-細(xì)菌混合物與量子點(diǎn)結(jié)合能特異性識(shí)別相應(yīng)的致病微生物，檢測(cè)限為1×104 CFU/ml，檢測(cè)在2 h內(nèi)完成[17]。

2.2量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)在生物毒素污染檢測(cè)中的研究生物毒素又稱天然毒素，是指生物來(lái)源并不可自復(fù)制的有毒化學(xué)物質(zhì)，包括動(dòng)物、植物、微生物產(chǎn)生的對(duì)其他生物物種有毒害作用的各種化學(xué)物質(zhì)。生物毒素除對(duì)人類的直接中毒危害外，還可以造成農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、水產(chǎn)業(yè)的損失和環(huán)境危害，因此，檢測(cè)食品中生物毒素是極其重要的。

Goldman等將重組蛋白結(jié)合于CdSe/ZnS核殼型量子點(diǎn)上，再與抗體相連，可用于熒光檢測(cè)葡萄球菌腸毒素B，檢測(cè)限為10 ng/ml[18]。Goldman等用不同粒徑CdSe/ZnS量子點(diǎn)分別標(biāo)記抗蓖麻毒素、霍亂毒素、志賀菌毒素l和葡萄球菌腸毒素B的抗體，可在同一塊微孔板上實(shí)現(xiàn)4種毒素的同時(shí)監(jiān)測(cè)，可獲得樣品中病毒的種類及含量[19]。楊淑平等分別采用巰基乙酸和谷胱甘肽作穩(wěn)定劑，水相合成CdTe量子點(diǎn)，再包覆CdS制備核殼型CdTe/CdS量子點(diǎn)[20]。以EDC/NHS作交聯(lián)劑將CdTe/CdS量子點(diǎn)標(biāo)記到嘔吐毒素抗體上，然后用牛血清蛋白封閉抗體。研究發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽穩(wěn)定劑優(yōu)于巰基乙酸。與CdTe量子點(diǎn)相比，谷胱甘肽修飾的CdTe/CdS量子點(diǎn)其熒光的強(qiáng)度和穩(wěn)定性分別提高6倍和2倍以上。谷胱甘肽碳鏈較長(zhǎng)，減少了量子點(diǎn)對(duì)抗體尤其是活性位點(diǎn)處的空間構(gòu)型影響，大大提高抗體的穩(wěn)定性。監(jiān)測(cè)不同儲(chǔ)藏時(shí)間（4 ℃）的CdTe/CdS量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)復(fù)合物與嘔吐毒素免疫反應(yīng)前后熒光強(qiáng)度變化值，結(jié)果顯示，抗體至少可以穩(wěn)定7 d。基于谷胱甘肽穩(wěn)定的高性能CdTe/CdS量子點(diǎn)，建立一種新的嘔吐毒素?zé)晒饷庖邫z測(cè)方法。嘔吐毒素濃度在0～0.9 ng/ml相對(duì)熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 2，檢出限是0.038 ng/ml。方法的靈敏度高于文獻(xiàn)報(bào)道的其他方法，如GCECD、HPLC和HPLCMS，已成功應(yīng)用于小麥面粉樣品中痕量嘔吐毒素的測(cè)定。

周曉燕等將谷胱甘肽作穩(wěn)定劑水相合成CdTe/CdS核殼型量子點(diǎn)，以EDC/NHS為活化劑對(duì)黃曲霉毒素B1（AFB1）抗體進(jìn)行量子點(diǎn)標(biāo)記，然后用牛血清蛋白封閉抗體[21]。通過對(duì)量子點(diǎn)和標(biāo)記抗體性能的研究發(fā)現(xiàn)，CdTe/CdS核殼型量子點(diǎn)熒光的強(qiáng)度和穩(wěn)定性較裸殼的CdTe量子點(diǎn)分別提高了4倍和2倍以上。由于谷胱甘肽碳鏈較長(zhǎng)，量子點(diǎn)對(duì)抗體尤其是活性位點(diǎn)處的空間構(gòu)型影響減少，從而改善了量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的穩(wěn)定性和活性，CdTe/CdS標(biāo)記的AFB1抗體與AFB1免疫前后熒光強(qiáng)度變化顯示抗體至少可以穩(wěn)定6 d。基于谷胱甘肽穩(wěn)定的高性能CdTe/CdS量子點(diǎn)，建立了一種熒光免疫檢測(cè)黃曲霉毒素B1的新方法。AFB1濃度在0.68～40 pmol/L，熒光強(qiáng)度與濃度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.991 4，檢出限為0.3 pmol/L。方法已成功應(yīng)用于米醋樣品中痕量黃曲霉毒素B1的測(cè)定。

孟元華等建立了一種基于CdSe/CdS量子點(diǎn)（QDs）標(biāo)記技術(shù)測(cè)定微囊藻毒素LR（MCLR）的方法[22]。MCLR抗體經(jīng)1乙基3（3二甲基胺基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）活化，與經(jīng)巰基乙酸修飾的CdSe/CdS量子點(diǎn)進(jìn)行共價(jià)連接，獲得的QDs生物共軛體在待測(cè)物MCLR的作用下發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象，熒光猝滅程度與MCLR的濃度呈線性關(guān)系。該方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、檢出限低達(dá)6.9×10-11mol/L。

2.3量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)在其他微生物污染檢測(cè)中的研究孔瀟藝等在2011年以量子點(diǎn)為探針建立簡(jiǎn)便快速的病原微生物檢測(cè)方法，采用配體交換法將具有微生物特異性的糖鏈，偶聯(lián)到CdSeS/ZnS量子點(diǎn)表面，制備2種糖量子點(diǎn)復(fù)合材料（甘露糖-量子點(diǎn)和半乳糖-量子點(diǎn)）。通過對(duì)它們的結(jié)構(gòu)、物性和光譜學(xué)特性進(jìn)行表征[23]，結(jié)果顯示，2種糖量子點(diǎn)均具有良好的水溶性、熒光發(fā)射和紫外-可見光吸收性能。進(jìn)一步以這2種糖量子點(diǎn)為探針與凝集素共孵育后，溶液顏色和熒光發(fā)射光譜的變化表明，甘露糖-量子點(diǎn)對(duì)刀豆蛋白具有特異性，最低可檢測(cè)濃度為95 nmol/L；而半乳糖-量子點(diǎn)對(duì)蓖麻毒素具有特異性，最低可檢測(cè)濃度為3 nmol/L。該研究為進(jìn)一步建立病原微生物的檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

3前景展望

社會(huì)的進(jìn)步和人們生活水平的提高對(duì)食品安全檢測(cè)技術(shù)提出了更高的要求，而傳統(tǒng)的檢測(cè)方法在一定的程度上已經(jīng)不能夠滿足現(xiàn)有的檢測(cè)要求。近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展和量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的日臻完善，量子點(diǎn)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用顯示了巨大的學(xué)術(shù)價(jià)值和良好的商業(yè)前景。在這樣的前提下，先進(jìn)的納米技術(shù)與傳統(tǒng)檢測(cè)方法的結(jié)合，產(chǎn)生了許多具有檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)靈敏度高的檢測(cè)方法，在很大程度上改變了食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀。這些方法在檢測(cè)靈敏度、檢測(cè)時(shí)間、檢測(cè)樣品量等方面都能夠很好地滿足目前嚴(yán)峻的食品安全檢測(cè)形勢(shì)，可以相信，當(dāng)前先進(jìn)量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法進(jìn)一步結(jié)合，將研究出更多新型簡(jiǎn)便可行的檢測(cè)方法，為食品安全檢測(cè)與監(jiān)控的進(jìn)一步發(fā)展提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持，從而充分保障人民群眾日常生活中的食品安全。

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