酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測豬肉中鹽酸克倫特羅

薛金英

鹽酸克倫特羅（俗稱瘦肉精）為一種人工合成的β-腎上腺素興奮劑，具有擴張支氣管的作用，常用來防治哮喘、肺氣腫等肺部疾病。當其應用量達到治療量的5～10倍時，其有能量重分配作用，可使肌肉合成增加，脂肪沉積減少，因此俗稱為“瘦肉精”。在畜牧業生產中一些非法使用者將其作為一種和生長促進劑添加到動物飼料中，用以改善胴體的品質，同時也造成食品中鹽酸克倫特羅（瘦肉精）的殘留。當人們食用鹽酸克倫特羅殘留的產品后會出現一系列的中毒癥狀。動物源性食品藥物殘留問題逐漸引起人們的重視。本法用于定量、定性檢測豬肉中鹽酸克倫特羅的殘留。

1試驗原理

采用間接競爭ELISA法，在微孔板上包被抗鹽酸克倫特羅檢測抗原，樣品中的鹽酸克倫特羅將和酶標板上的鹽酸克倫特羅檢測抗原競爭結合鹽酸克倫特羅抗體，鹽酸克倫特羅檢測抗原結合的鹽酸克倫特羅抗體再與同時加入的酶標二抗結合，洗滌后，用TMB底物系統顯色，微孔板吸光值與樣品中鹽酸克倫特羅含量成負相關，與標準曲線比較再乘以濃度比值即可得出鹽酸克倫特羅在樣品的實際含量。

2試驗方法（稀釋倍數為4倍）

稱取1.0 g（±0.05 g）均質樣品于50 mL聚苯乙烯離心管中，加入1 mL 0.1 M鹽酸，再加入2 mL提取工作液，充分振蕩混勻5 min，4 000 rpm（20～25℃）離心10 min。取1 mL上清液加入約25 μL 1 M 氫氧化鈉調節pH至6.5～7.5之間，充分振蕩混勻，取50 μL用于分析。如果上層中存在白色脂肪層，取樣時應避開。

試劑準備：將10×濃縮洗滌液和蒸餾水（或去離子水）按1∶9充分混勻，即為1×洗滌液。

編號：將鹽酸克倫特羅標準溶液和待測樣品對應微孔按序編號，建議每個標準溶液和待測樣品均做重復孔。

加樣：加入標準溶液或樣品50 μL，然后每孔分別加入鹽酸克倫特羅酶標二抗50 μL和鹽酸克倫特羅抗體溶液50 μL。

溫育：輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置于室溫（20～25℃）反應30 min。

洗滌：小心揭開封板膜，每孔加入1×洗滌液250 μL洗滌微孔板，連續洗板3次，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）。

顯色：將底物溶液A和底物溶液B按1∶1混合，振蕩混勻，每孔加入100 μL，室溫（20～25℃）避光顯色15 min。

測定：每孔加入終止液50 μL，輕輕振蕩混勻，5 min內測定450 nm處吸光度值。

3結果判定

計算B/B0 ：所獲得的標準溶液或待測樣品的吸光度值除以0號標準溶液的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。

式中：B ∶ 標準溶液或待測樣品溶液的吸光度值，B0 ∶ 0號標準溶液的吸光度值。

繪制標準曲線，計算樣品中鹽酸克倫特羅濃度：以鹽酸克倫特羅標準溶液濃度為X軸，對應的百分吸光度值為Y軸，在半對數坐標紙上繪制標準曲線。相對應每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣品中鹽酸克倫特羅的濃度。

鹽酸克倫特羅實際含量（μg/kg）=C×D

式中：C：稀釋后樣品提取液中鹽酸克倫特羅含量（μg/L），D：樣品稀釋倍數

注：為獲得樣品中鹽酸克倫特羅的實際含量（μg/kg），從標準曲線上讀出的濃度值應當乘以相應的稀釋倍數。

4結論

本試劑盒靈敏度為0.1 μg/L，樣品最低檢測限為0.4 μg/kg，回收率一般在80%～100%之間，為確保結果準確，試驗過程中應注意以下問題：

試劑盒保存于2～8℃，不能冷凍，未用的微孔板放回原鋁箔袋密封后2～8℃存放，并盡快使用。底物溶液要避光保存。使用之前，將樣品及所需試劑的溫度平衡至20～25℃，否則可能導致后面檢測吸光度值偏低。試劑使用完后應立即放回2～8℃冰箱。不要使用過期的試劑盒，不同批號試劑不能混用；洗板拍干后應立即進行下一步操作，如果洗板后出現板孔干燥，會導致標準曲線線性不好。底物溶液如果變藍表示已經變質，不能使用。0號標準溶液的吸光值< 0.6時，表示試劑盒已經變質，不能使用。反應終止液為2 M硫酸，應避免與皮膚和衣物接觸。（編輯：何芳）