三倍體枇杷莖尖培養與植株再生

陶煉等

摘 要 以三倍體枇杷莖尖為外植體，研究了取材時間及莖尖大小、植物生長調節劑對三倍體枇杷莖尖培養與植株再生過程中萌發、伸長、生根及移栽的影響。結果表明：春季取材且莖尖大小為0.7 cm時，莖尖成活率最高，為77.5%；初代培養適宜培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+IBA 1.5 mg/L，在此培養基上，三倍體枇杷莖尖萌發率高達91%；莖尖伸長適宜培養基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+GA3 0.3 mg/L，平均芽苗高度可達4.9 cm；芽苗增殖適宜培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+Tryptone 750 mg/L，增殖系數為7.7；生根適宜培養基為1/2MS+NAA 0.25 mg/L+IBA 2.0 mg/L，生根率為73.3%；三倍體枇杷組培苗移栽入腐熟有機肥 ∶ 園土 ∶ 鋸末（1 ∶ 2 ∶ 1）的基質中成活率達到93.67%。

關鍵詞 三倍體枇杷；莖尖培養；植株再生

中圖分類號 S667.304 文獻標識碼 A

Abstract Plant regeneration was completed for the first time using shoot tips as the explants harvested from a triploid mother plant in loquat. A series of experiments were carried out to investigate the effects of sampling time and the size of the explants，growth regulators on shoot tip sprouting，elongation，rooting and transplantation. The results showed that sampling in spring and shoot-tip size of 0.7 cm were appropriate，resulting in a survival rate of 77.5%. Appropriate initial culture medium was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L，in which the sprouting rate reached 91%. Suitable medium for shoot elongation was MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+GA3 0.3 mg/L，which resulted in an average shoot height of 4.9 cm. The most suitable medium for shoot proliferation was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+Tryptone 750 mg/L，in which a high multiplication coefficient of 7.7 was obtained. The most suitable medium for rooting was 1/2MS+NAA 0.25 mg/L+IBA 2.0 mg/L，in which the rooting rate was 73.3%. The rooted plantlets，after hardening，survived at a rate of 93.67% in the transplantation matrix of decomposed organic fertilizers，garden soil and sawdust（1 ∶ 2 ∶ 1）under careful temperature and water management.

Key words Triploid loquat； Shoot tip culture； Plant regeneration

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.025

枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）系薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae）枇杷屬（Eriobotrya）植物，原產中國西南（四川雅安市境內大渡河流域），已有2100多年的栽培歷史[1]，中國是世界枇杷的自然分布中心和栽培中心[2]。

枇杷果實中種子的重量約占果重的1/3，可食率不高，嚴重影響了枇杷的食用價值與商品價值[3]。因此，國內外科研人員長期致力于提高果實可食率的枇杷品種改良和新品種選育工作，其中重要途徑之一就是通過創制枇杷三倍體材料來培育無籽品種。至今，全世界創制出三倍體枇杷材料且尚有種質保存的僅有西南大學的梁國魯和四川農業大學的王永清，梁國魯的策略是從大量種子實生苗海選獲得天然枇杷三倍體[4]，王永清則另辟蹊徑，從控制授粉獲得的枇杷小種子植株中，獲得了高頻率的枇杷三倍體[5]。然而，三倍體枇杷因染色體組的原因表現出育性較低，在不施用生長調節物質的情況下坐果率較低，果實較小，商品性較差[6]，而利用轉基因技術對三倍體枇杷進行遺傳改良，減少其對外源生長調節物質的依賴，提高其坐果率，改善果實商品性則具有重要的理論和現實意義。

近年來，利用莖尖分生組織再生體系作為受體進行遺傳轉化在多種植物上已成功應用[7-10]。在枇杷上，二倍體材料莖尖培養和植株再生研究已取得一定進展[11-12]，三倍體枇杷莖尖培養由于莖尖茸毛多，酚類物質含量高等問題，再生難度大，至今未見任何報道。因此，本研究以四川農業大學自主創制的三倍體枇杷為材料，旨在建立三倍體枇杷莖尖培養和植株再生體系，為利用轉基因技術對三倍體枇杷進行遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以四川農業大學自主創制的三倍體枇杷（2n=3x=51）為材料（圖版Ⅰ-A），取其莖尖為外植體。

1.2 方法

1.2.1 初代培養 最佳取材時間及莖尖大小的篩選：分別選取春、夏、秋、冬梢莖尖為外植體，用75%酒精處理20 s，0.1%升汞處理8 min，無菌水沖洗多次后，將莖尖分為3個大?。?.4、0.7、1.0 cm），接種于MS基本培養基中，采用兩因素完全實驗設計，每組處理接種60個外植體，重復3次，14 d后統計褐化率（褐化的外植體數/接種的外植體數×100%）、污染率（污染的外植體數/接種的外植體數×100%）、成活率（成活的外植體數/接種的外植體數×100%），找出最佳的取材時期和莖尖大小。

初代培養基中生長調節劑的篩選：采用篩選出的外植體取材時期和莖尖大小，以MS為基本培養基，分別添加不同濃度的6-BA（1.0、2.0、3.0）mg/L、NAA（0.1、0.25、0.5）mg/L和IBA（0.5、1.0、1.5）mg/L，采用三因素三水平正交實驗設計，培養基中均附加瓊脂7.5 g/L、蔗糖30 g/L，pH5.8，每處理接種60個外植體，重復3次。接種后定期觀察莖尖生長狀況，30 d后統計萌發率（萌發的外植體數/成活的外植體數×100%）及平均芽苗高度。

1.2.2 芽苗伸長培養 將初代培養獲得的芽苗轉移到伸長培養基上，伸長培養基以MS為基本培養基，分別添加不同濃度的6-BA（0.5、1.0、1.5）mg/L，NAA（0.1、0.2、0.3）mg/L，GA3（0.1、0.2、0.3）mg/L，采用三因素三水平正交實驗設計，培養基中均附加瓊脂7.5 g/L、蔗糖30 g/L，pH5.8，每處理接種60個外植體，重復3次，接種后定期觀察芽苗生長狀況，30 d后統計芽苗高度及長勢。

1.2.3 芽苗增殖培養 將長1.0 cm左右的芽苗接種于增殖培養基上。增殖培養基以MS為基本培養基，分別添加不同濃度的6-BA（0.5、1.0、1.5）mg/L、NAA（0.1、0.3、0.5）mg/L和胰蛋白胨（250、500、750）mg/L，采用三因素三水平正交試驗設計，培養基中均附加瓊脂7.5 g/L、蔗糖30 g/L，pH5.8，每處理接種60個外植體，重復3次，接種后觀察并記錄芽苗增殖及長勢情況，培養30 d后統計增殖系數（≧0.5 cm叢生芽數/接種芽苗數）和芽苗長勢。

1.2.4 生根培養 當芽苗長至2 cm左右時，經切割后轉入生根培養基上，生根培養采用三因素三水平的正交試驗設計，基本培養基為（MS、1/2 MS、1/4 MS），IBA為（0、1.0、2.0）mg/L、NAA為（0、0.25、0.5）mg/L，培養基中同時附加瓊脂7.5 g/L、蔗糖30 g/L，pH5.8，每處理接種60個外植體，重復3次，接種10 d后開始觀察記錄生根情況，30 d時統計生根率（生根芽苗數/接種芽苗數×100%）、生根芽苗根數、平均根長，并觀察生根苗長勢。

1.2.5 煉苗和移栽 當生根苗長出3～5條根時即可進行煉苗移栽，方法是在培養室揭去封口膜培養3 d，然后取出試管苗洗去培養基，移栽到含有不同配比的基質中，每種基質移栽30株，重復3次，常規管理，30 d統計移栽成活率（移栽成活的組培苗數/移栽組培苗數×100%）。

1.3 培養條件

培養溫度（25±1）℃，光照時間14 h/d，光照強度為30 μmol/（m2·s）。

1.4 數據分析

所得數據用DPS 7.05軟件進行統計分析，多重比較采用Duncan新復極差法。

2 結果與分析

2.1 不同取材時間及莖尖大小對莖尖初代培養的影響

不同取材時間及莖尖大小對三倍體枇杷莖尖初代培養的影響見表1。從表1可以看出，冬季取材，成活率最低，為11.7%～28.9%；春季取材成活率最高，達58.9%～77.5%，為適宜的取材時間。春季取材時，當莖尖為0.4 cm時，莖尖成活率為58.9%，污染率為10.2%，均為最低；而褐化率卻最高，為35.6%。當莖尖為1.0 cm時，褐化率為同取材時期最低，僅為12.1%，但污染率較高，為20.2%。當莖尖大小為0.7 cm時，既能控制較低水平的污染率（11.1%）和褐化率（12.2%），又能保證較高的成活率（77.5%），為適宜的三倍體枇杷莖尖大小。

2.2 6-BA、NAA和IBA不同濃度配比對枇杷莖尖初代培養的影響

6-BA、NAA及IBA的不同濃度組合對三倍體枇杷莖尖初代培養具有明顯的影響（表2），當6-BA選用1.0 mg/L、NAA選用0.1 mg/L、IBA選用0.5 mg/L時，莖尖萌發率最低，僅為35.2%，極顯著地低于其他處理，芽苗高度為1.5 cm，纖細，長勢弱；當6-BA選用1.0 mg/L、NAA選用0.5 mg/L、IBA選用1.5 mg/L時，莖尖萌發率為91%，平均芽苗高度達2 cm，且長勢好（圖版Ⅰ-B）。綜上所述，適合三倍體枇杷莖尖的初代培養基為：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+IBA 1.5 mg/L。

2.3 6-BA、NAA和GA3對三倍體枇杷芽苗伸長的影響

6-BA、NAA和GA3對三倍體枇杷芽苗伸長的影響見表3。從表3可看出，6-BA對枇杷莖尖伸長的影響很大，較低濃度的6-BA（0.5 mg/L）與不同濃度的NAA和IBA組合，莖尖芽苗高度普遍較高，在3.8～4.9 cm之間，其次是較高濃度的6-BA（1.5 mg/L）與不同濃度的NAA和IBA組合，芽苗高度普遍在3.5～4.0 cm之間，而6-BA選用中濃度1.0 mg/L時，芽苗高度普遍較低，在2.3～3.3 cm之間；當6-BA濃度一定時，芽苗高度隨著NAA、GA3濃度的增加而升高，當6-BA選用0.5 mg/L、NAA選用0.3 mg/L、GA3選用0.3 mg/L時，芽苗高度達到最大值，為4.9 cm，且芽苗葉顏色深綠，長勢良好（圖版Ⅰ-C）?？梢?，MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+GA3 0.3 mg/L為三倍體枇杷體莖尖伸長培養的適宜培養基配方。

2.4 6-BA、NAA和Tryptone對三倍體枇杷芽苗增殖的影響

6-BA、NAA與Tryptone不同濃度配比對芽苗增殖的影響見表4。經7～10 d培養，芽苗的大部分腋芽開始萌動，培養30 d左右時已形成叢芽。6-BA濃度為1.0 mg/L，NAA濃度為0.3 mg/L，Tryptone濃度為750 mg/L的芽苗增殖系數最高，為7.7，極顯著高于其它處理，且芽苗長勢較好（圖版Ⅰ-D），其次為6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L與Tryptone 250 mg/L時，增殖系數為2.7，當6-BA濃度為0.5 mg/L、NAA濃度為0.5 mg/L、Tryptone濃度為750 mg/L時，增殖系數最低，僅為1.2，且芽苗基部愈傷化嚴重，長勢較弱。結合增殖系數及芽苗長勢，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+Tryptone 750 mg/L為芽苗增殖的適合培養基配方。

2.5 基本培養基和植物生長調節劑對三倍體枇杷芽苗生根的影響

基本培養基和植物生長調節劑對三倍體枇杷芽苗生根的影響見表5。從表5可以看出，基本培養基對三倍體枇杷芽苗生根差異明顯：以MS為基本培養基，未能生根，而以1/2MS、1/4MS為基本培養基均有不定根的發生，其中又以1/2MS為基本培養基的生根效果最好。植物生長調節劑對三倍體枇杷芽苗生根也有顯著的影響，培養基中僅添加IBA時，三倍體枇杷芽苗生根率較低，培養基中同時添加NAA和IBA時，芽苗生根率較高。當以1/2MS為基本培養基，同時添加NAA 0.25 mg/L、IBA 2.0 mg/L時，芽苗生根率最高，達73.3%，平均根數為5.1，平均根長為4.2 cm，生根苗長勢健壯（圖版Ⅰ-E）。由此可見，1/2MS+NAA 0.25 mg/L+IBA 2.0 mg/L為三倍體枇杷莖尖培養適宜的生根培養基。

2.6 煉苗和移栽

經煉苗移栽后的生根小植株，在不同的移栽基質里植株成活率和植株長勢差異較大。移栽基質配比為腐葉土 ∶ 珍珠巖=3 ∶ 1時，組培苗移栽成活率為57.27%，植株葉片小，莖桿細，長勢弱；移栽基質配比為腐熟有機肥 ∶ 園土 ∶ 鋸末=1 ∶ 2 ∶ 1時，組培苗移栽成活率達93.67%，植株葉片大，莖桿粗壯，葉色深綠，長勢健壯（圖版Ⅰ-F）。由此可見，腐熟有機肥 ∶ 園土 ∶ 鋸末=1 ∶ 2 ∶ 1為三倍體枇杷生根組培苗移栽的適宜基質。

3 討論與結論

成年枇杷植株的葉片培養極其困難，外植體褐化嚴重、愈傷組織分化率低，難以滿足遺傳轉化的需要，建立新的遺傳轉化受體系統非常必要。以莖尖作為外植體不需經過愈傷組織誘導及再分化成苗階段，實驗周期短，是遺傳轉化的良好受體材料，以此為受體的遺傳轉化在多種作物上得到了廣泛的應用，包括大豆[7]、玉米[8]、棉花[9]、向日葵[10]、葡萄[13]等。

影響莖尖萌發及生長的調節物質有BA、NAA、GA3、TDZ等，在已報道的薔薇科植物莖尖培養初代物建立選用最多的是BA和NAA[14-15]。而本研究結果表明：在三倍體枇杷莖尖培養萌發階段起著關鍵作用是IBA，在設定的濃度范圍內，三倍體枇杷莖尖的萌發率隨著IBA濃度的增加而增加，這與前人的結果不一致，這表明三倍體枇杷在莖尖初代培養中對生長調節物質的需求與二倍體枇杷是很不一樣的。在芽苗的伸長階段，GA3起著關鍵作用，這與陳君幟等[16]的研究結果一致。

薔薇科果樹的莖尖培養中，很多研究結果均表明存在著生根難的問題，降低無機鹽質量濃度配合一定濃度的生長素常常能解決生根難的問題[17]。例如，櫻桃在全量的MS培養基上不能生根，而在1/2MS培養基上可形成根或根原基，且在含有IBA的培養基上生根最好[18]；南果梨在MS培養基上只有極低的生根率，而在1/2MS+IBA生根率最高[19]；桃、杏莖尖芽苗在1/2F14+IBA或1/2MS+IBA生根率可達85%以上[17]。本研究也得到類似結果，在MS培養基上，三倍體枇杷芽苗不能生根，而低無機鹽濃度的基本培養基（1/2MS、1/4MS）配合生長素IBA和NAA則能生根，最高的可達73.3%。

本研究以三倍體枇杷莖尖為材料，首次成功再生出完整植株，建立了三倍體枇杷莖尖植株再生的基本技術體系，為利用轉基因技術對三倍體枇杷進行遺傳改良奠定了一定的基礎。

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