煙草青枯病菌巢式PCR檢測方法的建立及應用

李本金等

摘 要 利用細菌16S-23S rDNA內源轉錄間隔區通用引物L1/L2擴增煙草青枯病菌基因組DNA，并對其擴增產物進行克隆測序，經與近緣種序列多重比對分析后，設計1對特異性引物RsF/RsR，用于包括煙草青枯病菌在內的15種不同細菌、5種真菌、3種卵菌基因組DNA的PCR擴增。結果表明：在優化的反應體系與程序條件下，該對引物只能從煙草青枯病菌中擴增出241 bp的特異片段，并通過序列測定驗證了其準確性；將引物RsF/RsR與細菌通用引物L1/L2進行巢式PCR擴增后，其檢測靈敏度在DNA水平上可達0.4 fg/μL，較常規PCR 提高1 000倍，表明該對引物能有效地用于煙草組織及土壤中青枯病菌的檢測。此結果對煙草青枯病的早期診斷、快速檢測及病害流行學研究具有重要意義。

關鍵詞 煙草；青枯病菌；巢式PCR；分子檢測

中圖分類號 S435.72 文獻標識碼 A

Abstract Based on differences in the sequences of 16S-23S ribosomal DNA of Ralstonia solanacearum in tobacco and the other closely related species， a pair of primers RsF/RsR were designed and a PCR assay was developed in the study. Among 47 isolates representing 15 bacteria species including R. solanacearum in tobacco and 8 other fungi and oomycetes species， only a single PCR band of 241 bp amplified with DNA extracted from all isolates of R. solanacearum in tobacco， while other tested isolates had no corresponding band. The detection sensitivity increased 1 000-fold to 0.4 fg/μL genomic DNA by developed a nested PCR procedure with bacterial universal primer pair L1/L2 as the first round primers and RsF/RsR as the second round primers. The results showed that nested-PCR assays provided a rapid and sensitive method for the detection of R. solanacearum from naturally infected tobacco tissues and diseased soil samples. It has great significance for early diagnosis and rapid detection of tobacco bacterial wilt， and the research of disease epidemiology.

Key words Tobacco；Ralstonia solanacearum；Nested-PCR；Molecular detection

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.022

由青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum E. F. Smith）引起的煙草青枯病是威脅世界煙草生產的一種毀滅性病害，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區。該病在中國南方煙區普遍發生，近年來有逐漸加重的趨勢[1-3]。目前對煙草青枯病菌的檢測大多仍采用傳統的分離培養和血清學鑒定方法，傳統的檢測方法耗時長且靈敏度較低，難以滿足病害控制中快速、靈敏、穩定的檢測要求，很容易錯過病害防治的最佳時期，免疫血清學鑒定方法雖已建立，但血清的制備過程耗時耗力，且可能存在交叉反應，容易造成假陽性[4]，這些方法的應用均受到一定的限制。因此，建立一種快速、靈敏、準確的煙草青枯病菌檢測技術對該病及時、有效地防治具有十分重要的意義。

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術因其具有快速、特異、靈敏的特點已被廣泛應用于病原微生物的檢測。國內外應用PCR技術對青枯病菌的檢測研究已有報道，主要是針對青枯菌核糖體基因[1、5]、功能基因[1-3]及未知片段[6-7]設計引物進行檢測，其中核糖體轉錄間隔區ITS序列是由交替的保守區和可變區組成，在微生物基因組中以多拷貝出現，具有種的特異性，因此該序列成為在種的水平鑒定細菌極好的目標。目前，具有更高靈敏度的巢式PCR技術已在一些植物病原菌檢測中得以應用[8-10]，但有關煙草青枯病菌的檢測鮮有報道[11-12]，且靈敏度不太理想。為此，本研究根據16S-23S rDNA的ITS區段序列在細菌種間高度變異和種內穩定性特點，設計煙草青枯病菌特異性引物，并結合細菌通用引物建立巢式PCR檢測體系，對煙草青枯病菌及帶菌植株或土壤進行專化性檢測，以期為該病的早期診斷和及時采取有效的防控措施提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗供試菌株、寄主及來源詳見表1，所有菌株均保存于本實驗室。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 卵菌和真菌基因組DNA的提取參照改良的CTAB法[13]；細菌DNA的提取采用細菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；植物組織DNA的提取參照NaOH快速裂解法[14]；土壤DNA的提取采用土壤基因組DNA快速提取試劑盒（購自北京百泰克生物科技有限公司）。

1.2.2 16S-23S rDNA ITS序列擴增、克隆和測序 細菌16S-23S rDNA ITS序列擴增的通用引物為L1：5′-AGTCGTAACAACGTAGCCGT-3′和L2：5′-GTGCCAAGGCATCCACC-3′。采用25 μL反應體系：2.5 μL 10×PCR buffer（Mg2+ free），2.0 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，1.0 U Taq DNA聚合酶，10 μmol/L 的上、下引物各0.5 μL，25 ng DNA模板，不足部分由ddH2O補足。反應程序：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。擴增結束后取10.0 μL PCR產物于含0.5 μg/mL EB的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統上檢測并拍照。PCR擴增產物在T-vector上克隆后，由生工生物工程（上海）有限公司測序。

采用DNAMAN軟件對測序結果及GenBank數據庫中已登錄的青枯菌近緣種基因組序列進行同源性比較，選取差異位點進行引物設計。

1.2.3 特異性檢測 采用合成特異引物對供試菌株基因組DNA進行PCR擴增，并檢測其特異性，以滅菌的ddH2O為陰性對照。PCR反應體系同1.2.2。反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。擴增結束后取5 μL PCR產物于含0.5 μg/mL EB的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳30 min（100 V），在凝膠成像系統上檢測并拍照。PCR擴增產物進行克隆測序，通過序列比對驗證其準確性。

1.2.4 靈敏度檢測 采用10倍濃度系列稀釋法將提取的煙草青枯病菌基因組DNA依次稀釋成1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL共7個不同濃度梯度，采用巢式PCR對引物的靈敏度進行測定。分別取1 μL不同濃度的煙草青枯病菌基因組DNA為模板，以細菌16S rDNA通用引物L1/L2進行第1輪PCR擴增，反應體系和反應程序同1.2.2。反應結束后將PCR產物稀釋100倍，分別取1 μL做為DNA模板，用引物RsF/RsR進行第2輪PCR擴增，反應體系和反應程序同1.2.3。取5 μL第2輪PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 田間發病煙草植株或土壤的檢測 以從福建龍巖、三明、南平采集的32份青枯病典型癥狀或可疑癥狀的煙草植株及8份連作2～3 a發病煙田土樣基因組DNA為模板，將模板進行10、50、100、500、1 000倍稀釋，煙草植株采用常規PCR檢測，土壤樣品采用巢式PCR檢測。以煙草青枯病菌基因組DNA為陽性對照，以健康煙草組織作為陰性對照。

2 結果與分析

2.1 特異引物的設計

用細菌通用引物L1/L2對煙草青枯病菌基因組DNA進行PCR擴增，并對擴增產物克隆測序，根據測序結果，設計獲得煙草青枯病菌的特異引物，序列如下：RsF：5′-GGCGGCGAGAGCGATCT-3′，RsR：5′-ATTGCGCGCCTCATCAACGCG-3′。其包含引物序列在內的片段大小為241 bp。

2.2 引物特異性檢測

利用設計的特異性引物RsF/RsR對供試菌株（表1）的基因組DNA進行PCR擴增，進一步測序驗證的結果表明，只有在煙草青枯病菌中擴增到241 bp的目的條帶，測序比對后與煙草青枯病菌ITS片段序列完全一致，其它供試菌株和空白對照均未擴增到預期產物（圖1），表明該引物具有很高的特異性。

2.3 引物的靈敏性檢測

以L1/L2為外引物，RsF/RsR為內引物對不同濃度的煙草青枯病菌基因組DNA進行巢式PCR靈敏性驗證。結果第1次以L1/L2為引物擴增時，在25 μL反應體系中，以1 ng至10 pg的基因組DNA為模板時均能得到預期帶，表明其檢測的靈敏度為0.4 pg/μL；而第2次以RsF/RsR為引物擴增時，在以10 fg基因組DNA為模板時仍然可擴增到241 bp的特異條帶。可見，巢式PCR反應可使檢測靈敏度提高1 000倍，靈敏度達到0.4 fg/μL（圖2）。

2.4 煙草發病植株和土壤的檢測

采用常規、巢式PCR分別對采集的煙草植株、土壤樣本進行檢測，結果顯示，28份煙草植株及6份土樣為青枯病菌陽性，即能穩定地擴增出一條分子量為241 bp的特異條帶；6份樣本未獲得檢測，結果為陰性，部分電泳結果見圖3。對供試的煙草植株及土壤樣品采用常規分離培養及顯微鏡形態觀察的方法進行驗證，取得了一致的結果，說明該套技術能用于發病煙草組織或土壤中青枯病菌的快速檢測及病害的早期診斷。

3 討論與結論

核糖體轉錄間隔區是20世紀90年代發展起來的全新的分子標記。利用核糖體rDNA序列在物種進化過程中的保守性和異變性設計引物，并建立病原菌和快速檢測的方法已得到廣泛應用[15]。本研究根據測序得到的煙草青枯病菌序列與GenBank中已登錄的青枯菌近緣種rDNA-ITS區序列進行比對，設計出對煙草青枯病菌基因組DNA有高度特異性的1對引物，對15種不同細菌、5種真菌、3種卵菌基因組DNA進行PCR擴增，結果只有對不同來源的煙草青枯病菌能擴增出241 bp的特異性條帶，其余菌株DNA模板及空白對照均無擴增產物。利用此特異引物對發病的煙草植株或煙田土壤進行PCR或巢式PCR檢測，結果只能從煙草發病組織或帶菌土壤中擴增出目的條帶，而健康煙株或不帶菌土壤沒有目的條帶產生。表明此特異引物可用于煙草組織或煙田土壤青枯病菌的分子檢測及病害的早期診斷，為該病防控措施的制定提供重要保障。

目前已有利用PCR或巢式PCR技術對煙草青枯病菌進行檢測的報道[1-3、11、12、16]，但靈敏度較低。郭淼淼等[1]以青枯菌16S rDNA ITS及fliC基因為靶點設計引物對煙草青枯病菌進行檢測，其檢測靈敏度在DNA水平上均可達到l0 fg/μL；吳金鐘等[2]根據青枯菌egl基因設計煙草青枯病菌PCR引物，檢測靈敏度為100 fg/μL基因組DNA；楊姣弟等[3]根據青枯菌rpsS等基因序列差異設計特異性引物，對煙草青枯菌懸液最低檢出率為105 cfu/mL（據郭淼淼等報道，105 cfu/mL菌懸液相當于10 pg/μL基因組DNA）；賈春燕等[16]建立煙草青枯病菌的PCR檢測體系，對青枯菌基因組DNA檢測靈敏度為100 fg/μL。Poussier等[11]從hrp基因區域設計引物對青枯菌進行巢式PCR擴增，其檢測靈敏度為103 cfu/mL；Khakvar[12]等利用前人設計的引物通過巢式PCR檢測煙草組織或土壤中的青枯菌，檢測靈敏度為104～106 cfu/mL。據報道，巢式PCR與常規PCR相比，一般可將引物的靈敏度提高100～1 000倍[8-12]。為此，本研究在細菌ITS區通用引物L1/L2的內部設計了1對特異引物RsF/RsR，并建立煙草青枯病菌巢式PCR檢測體系，利用該體系對引物的靈敏性進行檢測，發現在25 μL反應體系中，以10 fg基因組DNA為模板時仍然可擴增到目的條帶，可見其檢測靈敏度在DNA水平上可達到0.4 fg/μL，比之前文獻中報道的更靈敏。

據報道，羅香文[17]設計的引物AU759/AU760不但可用于鑒定從辣椒上分離到的青枯病菌，也可鑒定從番茄、茄子、桉樹、甘薯、煙草、木麻黃等其他作物上分離到的青枯病菌；郭淼淼等[1]設計的引物對RaITS-1/2、Ralflic-F/R對煙草青枯菌、辣椒青枯菌、番茄青枯菌、苦瓜青枯菌、羅漢果青枯菌均是特異的、靈敏的。本研究設計的煙草青枯病菌特異引物，就擴增片段同源性比較結果來看，其他作物青枯病菌用該引物進行PCR，也有可能擴增出同樣大小的目的條帶，但若試圖用于其他寄主青枯病菌的檢測，還應進一步測試更多該寄主相關的病原菌。

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