云杉半乳葡甘露聚糖的結(jié)構(gòu)表征研究

吳先輝等

摘 要 借助現(xiàn)代儀器分析技術(shù)對GGM分子結(jié)構(gòu)與表面特征進(jìn)行表征，以期為其物理改性和應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)。結(jié)果表明：GGM分子鏈在3 352、2 930、1 639、1 354、1 230、1 028 cm出現(xiàn)特征吸收峰；β-（1→4）-D-吡喃式葡萄糖基和β-D-吡喃式甘露糖基以1，4甙鍵連接成主鏈，α-D-吡喃半乳糖基作為側(cè)鏈通過1，6甙鍵連接到主鏈上；單糖分子為螺旋、折疊、卷繞，單個(gè)的多糖分子鏈中存在側(cè)枝，多個(gè)分子鏈間互相纏繞，鏈間通過糖單元間不同的連接方式衍生許多環(huán)或帶有分支的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，具有高度分枝的化學(xué)結(jié)構(gòu)。單鏈的厚度小于2.8 nm，長度為50 nm～2 μm，寬度為10～40 nm；呈團(tuán)簇狀，小球狀外表有線狀絨毛。

關(guān)鍵詞 云杉半乳葡甘露聚糖；結(jié)構(gòu)表征；儀器分析

中圖分類號 S831.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract The molecule structure and surface characteristic of galactoglucomannan（GGM）in spruce were studied with instrumental analysis. The characteristic absorbance peaks were revealed at 3 352 cm、2 930 cm、1 639 cm、1 354 cm、1 230 cm、1 028 cm in the FT-IR spectrum The main chain of GGM is composed of 1，4 glycosidic bond， which were proved as β-（1→4）-D-glucopyranose and mannopyranose. The galactopyranose was the side chain， which was connected to the main chain by 1，6 glycosidic bond. The chain of GGM was not shown as linear but spiral， folding， winding and branch. The multiple branch structure of GGM was composed by variety of saccharide unit， bond and branch. The length and width were range from 50-2 μm and 10-40 nm， the thickness was less than 2.8 nm. The appearance of GGM was like cluster， as the linear velvet on the globe surface.

Key words GGM； Structural characterization； Instrumental analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.017

杉木是我國重要的用材樹種，具有生長快、產(chǎn)量高、材質(zhì)好、用途廣和易繁殖等特點(diǎn)[1-3]。目前，研究和開發(fā)較多的是杉木樹根、樹皮、樹葉和木材的抽提物，如杉木根精油、杉木葉黃酮類化合物等[4-5]，研究表明，杉木抽提物的功能奇特，廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)，如紫杉醇用于治療癌癥等[6-7]。

但杉木中還含有其他多種功能成分，如多糖、游離氨基酸、甾體類化合物、脂肪酸和維生素等，其中半纖維素多糖占20%～25%，而半纖維素多糖中含量最高的就是半乳葡甘露聚糖（galactoglucomannan，GGM），約占20%[8]，由β-D-吡喃式葡萄糖基和β-D-吡喃式甘露糖基以1，4甙鍵連接成主鏈，α-D-吡喃半乳糖基作為側(cè)鏈通過1，6甙鍵連接到主鏈上。GGM中含有大量的羥基，形成分子間或分子內(nèi)氫鍵，使GGM具有一定的流變性、持水性、膠凝性、成模性等特性[9-12]，然而關(guān)于GGM分子結(jié)構(gòu)和表面特征的結(jié)論至今尚未統(tǒng)一，這是限制其應(yīng)用的主要因素。目前，國內(nèi)對云杉GGM的研究較少，無相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，國外有部分學(xué)者在對云杉GGM進(jìn)行研究，但主要集中在云杉GGM的理化性質(zhì)方面，對結(jié)構(gòu)和表面特征研究較少[9-12]。基于此，本研究擬采用紅外光譜、核磁共振、原子力顯微鏡、掃描電子顯微鏡等近現(xiàn)代先進(jìn)技術(shù)研究GGM的結(jié)構(gòu)和表面特征，為其改性提供理論基礎(chǔ)與借鑒，以期為生產(chǎn)應(yīng)用提供必要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 從云杉中提取的半乳糖葡萄甘露聚糖（純度95.8%）。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備（表1）

1.2 方法

1.2.1 紅外光譜分析 紅外光譜儀是分析多糖結(jié)構(gòu)有力的工具，可幫助識別吡喃糖和呋喃糖，幫助確定糖苷鍵類型、糖的構(gòu)型以及多糖鏈上羥基的取代情況等信息。本實(shí)驗(yàn)采用Vector 33傅里葉變換紅外光譜儀對GGM分子鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，具體操作如下：將少量的GGM固體粉末加入到KBr粉末中，碾碎并攪拌均勻，用壓片機(jī)將樣品壓成薄片，將壓好的樣品薄片放置在傅立葉變換紅外光譜儀中，測定樣品的紅外吸收光譜，掃描的波長范圍為400～4 000 cm，測試前需要扣除背景譜圖。

1.2.2 核磁共振分析 將GGM樣品溶于重水（D2O）中，5 mm樣品管，測定溫度為室溫，在Bruker AVANCE Ⅲ 500儀器上測其波譜。500 MHZ NMR測氫譜，125 MHZ NMR測碳譜。

1.2.3 原子力顯微鏡觀察分析 稱1 mg樣品溶于1 mL純水中，稀釋至樣品濃度1×10-2 mg/L。采用5 500原子力顯微鏡測定GGM分子鏈三維形態(tài)與結(jié)構(gòu)。樣品尺寸≤10 mm，TM振動(dòng)模式，針尖為225 ym長Si（彈性常數(shù)為20～70 N/m），A型掃描頭，分辨率（以云母表面晶格為準(zhǔn)）XY方向<0.4 nm，Z方向<0.1 nm，針尖逼近行程≥20 mm，精度≤0.1衸，圖像均在Tapping模式下獲得；接觸作用力控制在3～4 nN量級以內(nèi)，所在實(shí)驗(yàn)均在大氣、常溫（20 ℃）和相對濕度30%下完成。

1.2.4 掃描電鏡測試 取少量GGM樣品均勻分散于帶雙面膠的樣品銅臺上，然后進(jìn)行噴金處理。測定條件：放大倍率：500～10 000倍；最大加速電壓：15 kV。掃描時(shí)將帶有樣品的銅臺置于掃描電鏡中，觀察顆粒表面形貌，選擇適宜的觀察倍數(shù)，挑取分離的、具有代表性的樣品進(jìn)行拍攝。

2 結(jié)果與分析

2.1 FT-IR圖譜分析

紅外光譜在4 000～400 cm區(qū)間進(jìn)行掃描（圖1），即為GGM的特征吸收峰：3 435.97 cm處出現(xiàn)的寬峰是O-H伸縮振動(dòng)峰，表明GGM存在分子間和分子內(nèi)氫鍵，分子主鏈上含有豐富的-OH；2 927.33 cm處出現(xiàn)的吸收峰是GGM-CH2-的C-H伸縮振動(dòng)引起的；1 735.58 cm處出現(xiàn)的吸收峰是C=O伸縮振動(dòng)引起的（極可能為醛基），1 636.50 cm處出現(xiàn)的吸收峰是半縮醛的C=O伸縮振動(dòng)引起的；1 420.18 cm處吸收峰是=CH2變形振動(dòng)引起的，1 383.51 cm處吸收峰是C-H彎曲振動(dòng)引起的，1 254.73 cm處吸收峰是O-H彎曲振動(dòng)引起的，這些峰是糖類的特征吸收峰；1 064.94 cm和1 030.35 cm處吸收峰是醇羥基（CH-OH）的C-O伸縮振動(dòng)引起的；895.70 cm處吸收峰是環(huán)氧（C-O-C）伸縮振動(dòng)和對稱振動(dòng)引起的，874.21 cm處存在β-型糖苷鍵的特征吸收峰。

2.2 核磁共振分析

核磁共振結(jié)果如圖2所示，1H-HMR譜圖中，多糖的異頭氫信號大多數(shù)集中在δ 4.0～5.5 ppm狹小的范圍內(nèi)，一般α構(gòu)型糖苷的異頭氫的共振比β構(gòu)型糖苷向低場位移0.3～0.5 ppm，一般地α構(gòu)型糖苷大于δ 5.0 ppm，β構(gòu)型糖苷小于δ 5.0 ppm。GGM的1H-HMR譜（圖2-a）顯示，C1的質(zhì)子信號在δ 4.4、5.4 ppm，這說明GGM的糖苷鍵存在α構(gòu)型和β構(gòu)型。

從GGD的13C-NMR譜（圖2-b）中分析，異頭碳信號集中在δ 60～80 ppm和δ 100～110 ppm，說明結(jié)構(gòu)為β-（1→4）-D-吡喃式葡萄糖基和β-D-吡喃式甘露糖基以1，4甙鍵連接成主鏈，α-D-吡喃半乳糖基作為側(cè)鏈通過1，6甙鍵連接到主鏈上。

2.3 原子力顯微鏡觀察分析

GGM的原子力顯微鏡照片如圖3所示，多糖大分子鏈呈現(xiàn)出多分枝的結(jié)構(gòu)。糖鏈的密集度依賴于其初始濃度及其沉積到云母表面的量；圖像的對比度依賴于針尖上的作用力，作用力太大易損壞糖鏈，太小則對比度差，很難得到清晰、穩(wěn)定的圖像，最佳的作用力大概在3～4 nN。

圖3-a和3-b是GGM在云母片上的AFM圖像，掃描范圍分別為50 μm×50 μm，從圖可以清楚地觀察到GGM分子的單分子形貌。單糖分子為鏈狀，但鏈狀分子并非直線形，而是發(fā)生螺旋、折疊、卷繞、分支。單個(gè)的多糖分子鏈中存在側(cè)枝，多個(gè)分子鏈間互相纏繞，鏈間通過糖單元間不同的連接方式衍生許多環(huán)或帶有分支的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，說明GGM具有高度分枝的化學(xué)結(jié)構(gòu)。單鏈的厚度小于2.8 nm，長度為50 nm～2 μm，寬度為10～40 nm，一般多糖的分子鏈大小為0.1～1.0 nm，本研究得到的圖像寬度遠(yuǎn)大于單鏈分子的估計(jì)值，原因可能是由于針尖在掃描時(shí)與分子間相互作用導(dǎo)致增寬效應(yīng)，以及由于糖鏈間范德瓦爾斯力相互作用及糖鏈與帶負(fù)電的云母表面產(chǎn)生相互作用，使得多糖鏈分子聚集平鋪在云母表面。

圖3-c和3-d是GGM分子的高分辨圖像，從圖中可明顯觀察到單個(gè)的分子鏈及其側(cè)枝結(jié)構(gòu)，以及分子內(nèi)的纏繞和螺旋狀結(jié)構(gòu)，螺圈相互連接成鏈，這些螺旋結(jié)構(gòu)的左旋和右旋，可能和多糖的L型與D型有關(guān)。

2.4 掃描電鏡分析

GGM的掃描電子顯微鏡照片如圖4所示，圖a～e分別放大500、1 000、2 000、5 000和10 000倍。從不斷放大的圖片可以較為清楚的看到GGM的形貌，500倍時(shí)外表呈現(xiàn)出雜亂絮狀團(tuán)簇狀，隨著倍數(shù)增加團(tuán)簇狀可看出一堆小球狀，單個(gè)小球狀的直徑為1～2 μm，圖d可模糊看出小球狀外表有絨毛，圖e放大到10 000倍清晰的看到小球狀外表有線狀絨毛。

3 結(jié)論

多糖的結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)，結(jié)構(gòu)分析在多糖的研究中具有非常重要的地位，是糖化學(xué)的核心。研究GGM分子鏈的結(jié)構(gòu)和表面特征，對其功能特性研究具有重要的意義。基于此，本文借助現(xiàn)代儀器分析技術(shù)對GGM分子結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行了表征。主要結(jié)論如下：

（1）紅外光譜分析結(jié)果顯示，GGM分子鏈在3 352、2 930、1 639、1 354、1 230、1 028 cm出現(xiàn)特征吸收峰。

（2）經(jīng)NMR鑒定GGM分子鏈結(jié)構(gòu)存在α構(gòu)型和β構(gòu)型糖苷鍵；β-（1→4）-D-吡喃式葡萄糖基和β-D-吡喃式甘露糖基以1，4甙鍵連接成主鏈，α-D-吡喃半乳糖基作為側(cè)鏈通過1，6甙鍵連接到主鏈上。

（3）經(jīng)NMR鑒定GGM單糖分子為鏈狀，但鏈狀分子并非直線形，而是發(fā)生螺旋、折疊、卷繞、分支。單個(gè)的多糖分子鏈中存在側(cè)枝，多個(gè)分子鏈間互相纏繞，鏈間通過糖單元間不同的連接方式衍生許多環(huán)或帶有分支的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，具有高度分枝的化學(xué)結(jié)構(gòu)。單鏈的厚度小于2.8 nm，長度為50 nm～2 μm，寬度為10～40 nm。

（4）掃描電子顯微鏡對樣品進(jìn)行掃描分析放大倍數(shù)從500倍10 000倍。從不斷放大的圖片可以較為清楚的看到GGM的形貌，呈團(tuán)簇狀，小球狀外表有線狀絨毛。

參考文獻(xiàn)

[1] 方來毅. 杉木優(yōu)良品系無性繁殖技術(shù)[J]. 林業(yè)科技開發(fā)， 2005， 19（6）： 79-80.

[2] 韋如萍， 胡德活， 鄭會(huì)全， 等. 杉木優(yōu)樹生長性狀和材質(zhì)性狀的研究[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 33（2）： 28-33.

[3] 鄭會(huì)全， 胡德活， 韋如萍， 等. 杉木速生無性系選擇與材質(zhì)分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2012， 28（12）： 27-31.

[4] 傅星星， 鄭德勇. 淺談杉木精油的開發(fā)前景[J]. 福建林業(yè)科技， 2008， 35（4）： 267-269.

[5] 張 曼， 劉進(jìn)鵬， 劉 娟， 等. 不同產(chǎn)地杉木枝葉中穗花杉雙黃酮的含量測定[J]. 藥學(xué)服務(wù)與研究， 2011， 11（2）： 149-150.

[6] 黃 鏡， 蔡銳剛， 孟平均， 等. 紫杉醇聯(lián)合順鉑治療晚期食管鱗癌[J]. 中華腫瘤雜志， 2004， 26（12）： 753-755.

[7] 呂紀(jì)馬， 王綠化， 周宗玫， 等. 放射治療同步紫杉醇化療局部晚期非小細(xì)胞肺癌的Ⅱ期臨床研究[J]. 中國放射腫瘤學(xué)雜志， 2004， 13（2）： 89-92.

[8] 鐘紀(jì)育. 半乳甘露聚糖類紅外光譜的研究[J]. 光譜學(xué)與光譜分析， 1985， （3）： 44-45， 63.

[9] 何曼君， 喻勤健， 裘月侶. 用粘度法測定半乳甘露聚糖的分子量和分子鏈構(gòu)型參數(shù)[J]. 高分子材料科學(xué)與工程， 1988， （3）： 21-28.

[10] 張廣倫， 肖正春. 半乳甘露聚糖膠的研究、 生產(chǎn)和應(yīng)用[J]. 中國野生植物， 1990， （2）： 1-5.

[11] 李國有， 楊永利， 陳 勇， 等. 不同方式制備長角豆半乳甘露聚糖樣品的原子力顯微鏡觀察[J]. 高分子材料科學(xué)與工程， 2006， （1）： 199-202.

[12] 劉玉紅， 王鳳山. 核磁共振波譜法在多糖結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用[J]. 食品與藥品， 2007， （8）： 39-43.

[13] Filip S E， Ana Ardá， Patrik Eklund， et al. Studies Related to Norway Spruce Galactoglucomannans： Chemical Synthesis， Conformation Analysis， NMR Spectroscopic Characterization， and Molecular Recognition of Model Compounds[J]. Chemistry-A European Journal， 2012， 18（45）： 14 392-14 405.

[14] Anna Ebringerová， Zdenka Hromádková， Vera Híbalová， et al. Norway spruce galactoglucomannans exhibiting immunomodulating and radical-scavenging activities[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2008， 42（1）： 1-5.

[15] Chunlin Xu， Ann-Sofie Leppanen， Patrik Eklund， et al. Acetylation and characterization of spruce（Picea abies）galactoglucomannans[J]. Carbohydrate Research， 2010， 345（6）： 810-816.

[16] Chunlin Xu， Stefan Willfor， Peter Holmlund， et al. Rheological properties of water-soluble spruce O-acetyl galactoglucomannans[J]. Carbohydrate Polymers， 2009， 75（3）： 498-504.