電子鼻在芒果采后病原菌種類判別中的應(yīng)用研究

李敏 胡美姣 張正科 梁秋南 楊冬平 陳亮 鄭淑英 高兆銀

摘 要 利用電子鼻對(duì)膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）、可可球二孢（Botryodiplodia theobromae Pat.）、芒果小穴殼（Dothiorella dominicana Pet. et Cif.）和芒果擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis mangiferae Ahmad.）4種芒果采后病害病原菌發(fā)酵液的揮發(fā)性氣味進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)估電子鼻用于芒果不同真菌病原菌種類判別的可行性。結(jié)果表明，對(duì)氣味響應(yīng)值進(jìn)行的主成分分析（PCA）、線性判別分析（LDA）及聚類分析均能夠正確區(qū)分不同病原菌種類。多因素方差分析（MANOVA）結(jié)果顯示，不同病原菌之間的差異顯著（p<0.05）。結(jié)果為芒果采后病原菌種類判別提供新的方法，為其他病原菌的種類判別提供參考。

關(guān)鍵詞 芒果；電子鼻；病原菌；主成分分析；線性判別分析；聚類分析；多因素方差分析

中圖分類號(hào) S667.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

通常病原真菌的種類鑒定以觀察其形態(tài)學(xué)特征為主，另外可通過病菌rDNA-ITS序列對(duì)比分析做進(jìn)一步驗(yàn)證。然而利用形態(tài)學(xué)進(jìn)行種類判斷時(shí)，常出現(xiàn)因培養(yǎng)條件不適合或培養(yǎng)時(shí)間短，造成病菌產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子缺失現(xiàn)象，給鑒定工作帶來一定的困難和限制。利用對(duì)比rDNA-ITS序列等分子生物學(xué)手段進(jìn)行輔助驗(yàn)證也需要一定周期。然而有研究發(fā)現(xiàn)，真菌可以釋放出多種揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOC）[1-2]，GC-MS分析表明其包含如單萜，倍半萜，醇類、醛、芳香族化合物，碳?xì)浠衔铮ィ秽秃蚧衔锏萚3-5]。而電子鼻可以分析、識(shí)別和檢測(cè)復(fù)雜嗅味及大多數(shù)揮發(fā)性成份。其通常由若干氣敏傳感器組成傳感器陣列進(jìn)行氣體揮發(fā)性物質(zhì)的復(fù)合檢測(cè)和識(shí)別，陣列中每一個(gè)傳感器對(duì)某些特定種類的氣體成分敏感，使得整個(gè)電子鼻能夠?qū)怏w中不同的成分進(jìn)行識(shí)別并給出總體評(píng)價(jià)。目前已廣泛用于農(nóng)畜產(chǎn)品的品質(zhì)檢測(cè)和分級(jí)。在水果成熟度監(jiān)控、貨架期判斷、水果種類鑒定等方面均有一定的應(yīng)用價(jià)值[6-8]。有研究結(jié)果表明，電子鼻技術(shù)能夠?qū)λ{(lán)莓[9]和草莓[10]是否早期感染病害做出較準(zhǔn)確的判斷。膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）、可可球二孢（Botryodiplodia theobromae Pat.）、芒果小穴殼（Dothiorella dominicana Pet. et Cif.）和芒果擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis mangiferae Ahmad.）[11]是芒果采后病害主要病原菌，本研究擬以芒果采后病害主要病原菌為研究對(duì)象，應(yīng)用電子鼻測(cè)定這4種病原菌發(fā)酵液的氣味響應(yīng)值，通過主成分分析、線性判別式分析等方法探討基于電子鼻區(qū)分不同芒果采后病原菌的可行性，為芒果采后病原菌種類判斷提供有效的輔助手段。

1 材料與方法

1.1 病原菌

芒果采后常見4種病原真菌：膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.，CG）（3株菌株，編號(hào)分別為CG1、CG2、CG3）、可可球二孢（Botryodiplodia theobromae Pat.，BT）（3株菌株，編號(hào)BT1、BT2、BT3）、芒果小穴殼（Dothiorella dominicana Pet. et Cif.，DD）（3株菌株，編號(hào)DD1、DD2、DD3）和芒果擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis mangiferae Ahmad.，PM）（3株菌株，編號(hào)PM1、PM2、PM3），均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所采后病害及貯運(yùn)保鮮實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定、保存。

1.2 傳感器響應(yīng)值測(cè)定

將12株菌株分別置于PDA培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng) 5 d后，取6塊病菌菌餅（Φ=5 mm）接種到含100 mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，置于28 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。再應(yīng)用德國AIRSENSE公司PEN3便攜式電子鼻獲取菌株發(fā)酵液氣味的響應(yīng)值。電子鼻傳感器陣列包含10個(gè)傳感器（見表1）。測(cè)定時(shí)，傳感器涂層吸附樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生電導(dǎo)率變化，記錄傳感器吸附樣品揮發(fā)物后的電導(dǎo)率G與傳感器吸附經(jīng)活性碳過濾的空氣后的電導(dǎo)率G0的比值G/G0（即相對(duì)電導(dǎo)率），響應(yīng)氣體濃度越大，G/G0的值越偏離1，如果濃度低于檢測(cè)限或者沒有感應(yīng)氣體，則該比值接近甚至等于1。

1.3 傳感器響應(yīng)值數(shù)據(jù)處理

采用電子鼻自帶的 Winmuster 軟件進(jìn)行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）、線性判別分析（Linear Discriminant Analysis，LDA）、載荷分析（loading Analysis）。利用軟件SPSS進(jìn)行多因素方差分析、聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 主成分分析（PCA）

利用48、49、50 s時(shí)的響應(yīng)值進(jìn)行主成分分析（PCA），結(jié)果表明，第一主成分（PC1）區(qū)分貢獻(xiàn)率為98.98%，區(qū)分貢獻(xiàn)率大于90%，表明第一主成分已經(jīng)基本代表了樣品的主要信息特征（圖1）。第二主成分（PC2）區(qū)分貢獻(xiàn)率僅為0.63%，但在區(qū)分不同病菌種類中起重要作用。通過PCA分析發(fā)現(xiàn)，相同的病原菌分別聚在相近的位置，從而可以將4種病原菌較好的區(qū)分開來。其中B. theobromae和其它3種病菌的距離最遠(yuǎn)，且3株B. theobromae的距離也相對(duì)較大。C. gloeosporioides、D. dominicana和P.mangiferae在第一主成分上差異較小，三者之間的區(qū)別主要體現(xiàn)在第二主成分上。

2.2 線性判別（LDA）分析

利用傳感器第48、49、50 s時(shí)的響應(yīng)值進(jìn)行線性判別式（LDA）分析，結(jié)果表明， 第一判別式（LD1）的貢獻(xiàn)率為98.95%，大于90%，已經(jīng)基本代表了樣品的主要信息特征（圖2）。第二判別式（LD2）的貢獻(xiàn)率僅為0.83%，但在區(qū)分不同病菌種類中起關(guān)鍵作用。利用線性判別式分析，可以將BT、CG、DD、PM這4種不同的病原菌很好的區(qū)分開，相同的病原菌分別落在相近的位置（圖1，2），B. theobromae和其它3種病菌的區(qū)別較大，而C. gloeosporioides、D. dominicana和P.mangiferae的區(qū)別主要體現(xiàn)于第二判別式。

2.3 載荷（loading）分析

通過載荷分析，可以得出電子鼻的10個(gè)傳感器分別對(duì)樣品的PCA主成分分析的貢獻(xiàn)率。其中S7號(hào)傳感器對(duì)第一主成分區(qū)分和第二主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率最大。S2、S6、S8、S9號(hào)傳感器對(duì)第一主成分貢獻(xiàn)率較大；S2、S7、S8號(hào)3個(gè)傳感器對(duì)應(yīng)的點(diǎn)在第一象限中距離很近，說明這3個(gè)傳感器的響應(yīng)值并不是菌株揮發(fā)性氣體的特征信號(hào)，S1、S3、S4、S5、S10這5個(gè)傳感器對(duì)第一主成分區(qū)分和第二主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率均很小（圖3）。

2.4 響應(yīng)值方差分析

利用病原菌對(duì)電子鼻傳感器第50 s的響應(yīng)值進(jìn)行多因素方差分析，結(jié)果如表2所示。其中 Wilks'Lambda表示組內(nèi)變異與總變異的比值，在0～1之間； Wilks' Lambda值越接近1，表示各個(gè)組間的差異越小；Wilks'Lambda越接近0，表示組間差異越大。由表2可知，4種病原菌間響應(yīng)值的Wilks'Lambda均接近0，說明不同病菌間有明顯差異，差異水平顯著（p<0.05）。

2.5 不同病原菌響應(yīng)值的聚類分析

利用12株病原真菌對(duì)電子鼻傳感器第50s的特征響應(yīng)值，按照系統(tǒng)聚類的歐氏距離ward法進(jìn)行系統(tǒng)聚類，結(jié)果表明（圖4），同種的3株病原真菌分別聚成一類。不同病原菌之間關(guān)系有差別。其中C. gloeosporioides和D. dominicana的距離最近，其次是P. mangiferae；B. theobromae與其它3種病原菌的距離較遠(yuǎn)。

3 討論與結(jié)論

真菌可以釋放出多種揮發(fā)性物質(zhì)[1-2]，但揮發(fā)物的氣味特征和種類之間是否有相關(guān)性、是否能根據(jù)氣味特征進(jìn)行種類的識(shí)別等尚未見報(bào)道。本文利用電子鼻對(duì)不同芒果4種病原真菌發(fā)酵液進(jìn)行氣味的測(cè)定，并對(duì)10組傳感器的響應(yīng)值進(jìn)行了PCA分析、LDA分析、方差分析和聚類分析，每種分析結(jié)果均可把同種病原菌的3株菌株劃為一組，從而較好區(qū)別不同的病原菌，初步證明同種病菌的發(fā)酵液具有相似的揮發(fā)性氣味，且有區(qū)別于其他病菌。聚類分析的結(jié)果表明，C. gloeosporioides和D. dominicana的距離最近，說明其發(fā)酵液氣味較相近，B. theobromae與其它病原菌的氣味差異較大。筆者利用Genebank上rDNA-ITS序列構(gòu)建4種病原菌系統(tǒng)進(jìn)化樹的聚類結(jié)果表明，C. gloeosporioides和P.mangiferae關(guān)系較近，而B. theobromae和D. dominicana的關(guān)系較近。該結(jié)果與電子鼻傳感器響應(yīng)值的聚類結(jié)果有很大差異。說明供試病菌的氣味差異與其親緣關(guān)系的親疏沒有相關(guān)性。

朱娜等[10]利用電子鼻特征傳感器響應(yīng)值，構(gòu)建了草莓感染3種霉菌類型的判別模型，判別準(zhǔn)確率達(dá) 95%以上。本研究中由于沒有足夠的實(shí)驗(yàn)樣本量，無法運(yùn)用Fisher 線性判別分析等方法構(gòu)建判別模型，在后期研究中，增加每種病菌的實(shí)驗(yàn)樣本量，建立準(zhǔn)確的病菌類型判別數(shù)學(xué)模型，從而實(shí)現(xiàn)利用電子鼻進(jìn)行4種芒果采后病害種類的準(zhǔn)確區(qū)分和判別。為芒果采后病原菌種類的判斷提供有效的輔助手段。

參考文獻(xiàn)

[1] Splivallo R， Ottonello S， Mello A， et al. Truffle volatiles： from chemical ecology to aroma biosynthesis[J]. New Phytologist， 2011， 189： 688-699.

[2] Kramer R， Abraham W R. Volatile sesquiterpenes from fungi： what are they good for？[J]. Phytochemistry Reviews， 2012（11）： 15-37.

[3] Splivallo R， Bossi S， Maffei M， et al. Discrimination of truffle fruiting body versus mycelial aromas by stir bar sorptive extraction[J]. Phytochemistry， 2007， 68： 2 584-2 598.

[4] Campos V P， Pinho de R S C， Freire E S. Volatiles produced by interacting microorganisms potentially useful for the control of plant pathogens[J]. Ciência e Agrotecnologia， 2010， 34： 525-535.

[5] Anna Müller， Patrick Faubert， Michael Hagen， et al. Volatile profiles offungi-Chemotyping of species and ecological functions[J]. Fungal Genetics and Biology， 2013， 54： 25-33.

[6] Pallottino F， Costa C， Antonucci F， et al. Electronic nose application for determination of Penicillium digitatum in Valencia oranges[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2012， 92（9）： 2 008-2 012.

[7] Li Z F， Wang N， Vijaya Raghavan G S， et al. Ripeness and rot evaluation of ‘Tommy Atkins mango fruit through volatiles detection[J]. Journal of Food Engineering， 2009， 91（2）： 319-324.

[8] 江琳琳， 潘磊慶， 屠 康， 等. 基于電子鼻對(duì)水蜜桃貨架期評(píng)價(jià)的研究[J]. 食品科學(xué)， 2010， 31（12）： 229-232.

[9] Changying L， Gerard W K， Pingsheng J， et al. Gas sensor array for blueberry fruit disease detection and classification[J].Postharvest Biology and Technology， 2010， 55： 144-149.

[10] 朱 娜， 毛淑波， 潘磊慶， 等. 電子鼻對(duì)草莓采后貯藏早期霉菌感染的檢測(cè)[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)， 2013， 29（5）： 266-273.

[11] 胡美姣， 李 敏， 高兆銀， 等. 熱帶亞熱帶水果采后病害及防治[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2010.