鴿源新城疫病毒的分離與鑒定

董孝乾 孔艷 高月花 王震 劉妮妮 史效茹 李園

摘 要：山西地區某商品信鴿養殖場的信鴿死亡淘汰率突然增加，這些病鴿主要表現為食欲下降、排白綠色稀糞，頭頸斜仰扭轉于頸后、呈現觀星狀，表現出一種典型神經癥狀。主要剖檢癥狀為內臟器官不同程度的腫脹與出血，結合流行病學、臨床癥狀、病例剖解變化，經實驗室細菌分離、病毒分離以及RT-PCR檢測，最終被確診為鴿新城疫。

關鍵詞：鴿；新城疫；細菌分離；病毒分離；RT-PCR

中圖分類號：S858.39 文獻標識碼：B 文章編號：1673-1085（2014）11-0011-04

鴿新城疫是由副粘病毒科副粘病毒屬禽I型副粘病毒[1]感染引起的一種高度接觸性、急性敗血性傳染病[2]。該病發病急，傳播迅速，死亡率高，是養鴿業的最大危害之一[3]。臨床主要表現為體溫升高、食欲下降，羽毛失去光澤；排白綠色稀糞；發病2～3d后出現典型的神經癥狀，頭頸震顫，一側或者兩側翅或腿麻痹，共濟失調，頭頸歪斜或頭扭轉置于背上呈特殊的觀星狀[4]，最終麻痹死亡。2013年8月山西某養殖場的信鴿出現神經系統、消化系統與呼吸系統混合感染癥狀的疾病，根據其臨床癥狀疑為鴿新城疫。經實驗室病原分離及RT-PCR方法檢測證實為鴿新城疫，現將分離鑒定流程及結果作如下報告：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 病鴿來源于山西地區某信鴿養殖場，病鴿為28～50日齡。養殖戶采取家養方式飼養。

1.1.2 試驗用雞胚 10日齡SPF雞胚，由山東無特定病原雞實驗種雞場提供。

1.1.3 試驗動物 10日齡SPF雛雞，由山東無特定病原雞實驗種雞場提供種蛋，公司SPF實驗動物房孵化出雛，實驗動物房負壓隔離器內飼養至所需日齡。

1.1.4 1%雞紅細胞 取SPF公雞血5ml，加入抗凝劑，生理鹽水沖洗、1500rpm/min離心7min，反復操作3次，制備雞紅細胞懸液。

1.1.5 培養基及生化試劑 NDV標準強毒株F48E9及NDV陽性血清，均由山東省農業科學院家禽研究所禽病研究室保存。

禽流感（AIV H9）標準陽性血清，來自于農業部動物衛生檢疫所。

AIV雞減蛋綜合征（EDS）標準陽性血清，購自于中國獸醫微生物菌種保藏中心。

Taq酶、PCR Marker以及M-MLV反轉錄試劑盒等，購自大連寶生物工程有限公司。

細菌培養基及其他生化試劑均購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病鴿解剖觀察 采用常規解剖方法對病鴿進行解剖，觀察病鴿的組織器官病理變化，并無菌采集病料。

1.2.2 病料處理 對無菌采集病鴿腸道、氣管、肝臟、腎臟以及腦組織進行如下處理：其中腸道、氣管、肝臟、腎臟混合加入含有2000IU/ml[5]雙抗的生理鹽水進行研磨，腦組織單獨進行研磨，獲取研磨液。將研磨液反復凍融三次，8000rpm/min離心15min，過濾除菌，獲取上清液。

1.2.3 無菌檢測 取反復凍融后的上清液進行細菌分離，無菌接種血清平板，37℃培養，24～48h[4]觀察是否有細菌生長。

1.2.4 病毒分離 取反復凍融后的上清液接種11日齡雞胚，每枚雞胚接種0.1ml，37℃孵化120h，24h內死胚棄去，收集24～120h死亡雞胚尿囊液，測定尿囊液是否有血凝性，并觀察雞胚病理變化。將尿囊液進行適當稀釋，進行盲傳，測定其血凝效價，盲傳至血凝價不再發生變化，按照Reed和Muench法計算ELD50[6]，并且計算10日齡雞胚的平均死亡時間MDT[2]，即MDT=（Ah死亡雞胚數×Ah+Bh死亡雞胚數×Bh+……）/死亡雞胚總數。

1.2.5 病毒鑒定

1.2.5.1 HA與HI試驗 將無菌收獲的尿囊液進行血凝（HA）試驗，如果出現血凝，用雞NDV、EDS、AIV H9標準陽性血清進行血凝（HI）抑制試驗，觀察試驗結果。

1.2.5.2 RT-PCR 參照已發表鴿NDV序列，設計一對檢測引物：正鏈引物為：5' -AGTGTAGCTCTTGGGGTTG-3'，負鏈引物為5'-ACTGCTGCATCTTCCCAAC-3'，擴增片段大小為184bp。另針對鴿NDV F基因，設計一對引物用于擴增F基因全序列：正鏈引物為5'-ATGGGCTCCAAACCTTCTAC-3'，負鏈引物為5'-TTGTAGTGGCTCTCATC-3'。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。雞胚尿囊液及病料組織RNA提取按試劑盒說明進行。取DEPC水溶解后的RNA模板，加正鏈引物1μl，于70℃作用5min后，分別加入5×reaction buffer 4μl，Ribonuclease inhibitor 1μl，10mmol/L dNTP 2μl，M-MLV反轉錄酶1μl，冰浴混勻，37℃ 60min，70min作用10min，反轉錄完成；取反轉錄產物為模板進行PCR，反應體系如下：RT產物5μl，正負鏈引物各1μl，10×PCR緩沖液2.5μl，10mmol/L dNTPs 1.25μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至總體積25μl，反應條件如下：94℃ 3min，然后94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 60s，共進行30個循環，最后72℃延伸10min，取5μl反應產物進行瓊脂糖凝電泳鑒定。回收F基因擴增產物，進行克隆測序，利用MEGA軟件進行遺傳進化分析。

2 試驗結果

2.1 臨床癥狀 病鴿表現為精神萎頓，食欲下降，厭食，并出現明顯的神經癥狀，表現為頭頸斜仰扭轉于頸后、頭向后側仰呈觀星癥狀；眼睛病變主要表現為凹陷、部分病鴿眼睛出現炎癥，具有膿性分泌物；病鴿出現明顯的綠色糞便，肛門周圍被綠色糞便污染。

2.2 病理剖檢病變 氣管內有粘性分泌物，氣管環出血；喉頭、腸道以及腦組織有不同程度的出血；腎臟腫脹明顯，并出血；消化道、呼吸道有較多粘液回流，肌胃充滿綠色內容物；腦組織水腫、充血，并伴有少量出血點；肝臟輕微腫大，邊緣出現不同程度壞死；氣囊渾濁，周圍有白色干酪物附著。

2.3 無菌檢測 24～48h，觀察已接種血清平板，均無細菌生長。

2.4 病毒分離 死亡雞胚尿囊液，初代最高血凝價為1：22，盲傳五代之后血凝價達到1：28。生物學特性測定，對鴿子病料進行105、106、107倍稀釋，測得 ELD50=106.5；第一代MDT=72.35h，第二代MDT=86.32h，第三代MDT=83h，第四代MDT=77h，第五代MDT=66.7h，第六代MDT=55.7h。

2.4.1 初代雞胚病變 48h死亡雞胚瘦小，胚體充血嚴重，并伴有不同程度出血，尤以頸部出血嚴重；92、102h死亡雞胚全身水腫，出血嚴重，肝臟表現為嚴重的花斑樣，肌胃出血嚴重，尿囊液渾濁且粘稠。

2.4.2 盲傳雞胚病變 死亡雞胚尿囊液粘稠，全身水腫，出血嚴重，腎臟腫大出血，全部胚體肝臟出現明顯的花斑樣，腹腔內充滿乳白色液體，肌胃與脾臟出血嚴重；盲傳第4代雞胚尿囊液清亮，其余病變與前幾代相比沒有明顯變化；盲傳第6代胚體整體表現瘦小，出血與水腫現象有一定程度的減輕，花斑肝現象明顯減輕，只有個別胚體出現，其他病變無明顯變化。

2.5 病毒鑒定

2.5.1 HA與HI試驗 雞胚尿囊液出現明顯的血凝現象，這種血凝現象能夠被NDV標準陽性血清抑制，而不被EDS、AIV H9標準陽性血清所抑制，這說明分離到的病原為新城疫病毒，并將該毒株命名為APMV-1/Pigeon/China/SX13/2013（簡稱SX13）。

2.5.2 RT-PCR 病料上清和雞胚尿囊液PCR產物電泳后均出現184bp條帶，說明新城疫核酸檢測均為陽性，見圖1。該毒株F基因ORF全長為1662bp，裂解位點氨基酸序列為112RRQKRF117，在114位Q的兩側為2對堿性氨基酸，第117位為F，符合強毒裂解位點序列特征[7]。利用MEGA軟件對其進行遺傳進化分析表明，該病毒屬基因VI型，見圖2。

3 分析討論

3.1 病鴿臨床癥狀和病理剖檢病變均與雞新城疫癥狀有很多相似之處，尤以神經系統與呼吸消化系統變化最為相似，根據以上癥狀初步診斷為新城疫病毒感染。通過對病鴿的實驗室細菌分離、病毒分離以及RT-PCR檢測，最終確診為鴿新城疫。

3.2 本次實驗，用最初的病料作盲傳，血凝價并不高，盲傳到第三代血凝價僅為1：24；第六代時，血凝價較高，達到1：28，血凝價趨于穩定，這提示我們在從事病原的分離與鑒定時，第一代沒有出現血凝價時，要多盲傳幾代，以免因分離不徹底而影響結果判斷，造成不必要的損失[8]。通過MDT數值可知，MDT的數值從第二代至第六代逐漸變小，這說明該病原在一定盲傳代數內，每盲傳一代，10日齡雞胚的平均死亡時間呈現總體縮短的趨勢，病毒致病力有所增強；從MDT數值上分析，結合ELD50=106.5確定該致病原為新城疫中強毒株。

3.3 新城疫是商品鴿所有疫病中發生頻率最高、危害最大的一類傳染病，約占臨床病例的20%～30%。該病在上世紀80年代初開始在我國流行，并逐年增多，現已廣泛流行于我國各地區。該病的發生沒有明顯的季節性，不同品種、日齡的鴿均可感染此病，但幼鴿更易感。該病的傳播途徑是消化道和呼吸道，是一種接觸性傳播疾病，自然感染的鴿群發病率和死亡率變化較大，一般在20%～90%，幼鴿可達100%[5]。

傳統的檢測方法需經病毒分離后，再通過血清學試驗判斷是否為NDV感染，耗時耗力。本文中同時采用了病毒分離、血清學實驗以及RT-PCR兩種方法進行診斷，前者需經至少60h才能得出結果，而RT-PCR方法在8h之內即可判斷核酸檢測是否為陽性，就可以確定是否為新城疫感染，這大大節約了診斷時間，更加有利于該病的診斷與防控。

從病毒基因型上講，鴿源NDV絕大多數為基因Ⅵ型，而雞源強毒NDV一般為Ⅶ型，二者致病性有所不同，抗原性之間也有一定差異，但目前市場上仍無鴿專用的新城疫疫苗，一旦發生該病，可用雞新城疫La Sota、Clone30等弱毒疫苗緊急接種。通常情況下，建議一周日齡左右雛鴿進行一次新城疫弱毒疫苗免疫，青年鴿在1月齡左右進行一次滅活疫苗免疫，種鴿留種前根據抗體水平適當進行1～2次滅活疫苗免疫，基本可以對本病起到較好的防控作用。

參考文獻：

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