冷凍對哺乳動物胚胎發育分子調控的影響

寧效斌　蘇雷

摘要 綜述了幾種與哺乳動物胚胎發育分子調控相關的重要蛋白質以及超低溫冷凍保存在分子水平上對胚胎發育的影響。

關鍵詞 哺乳動物；冷凍；胚胎發育；分子調控

中圖分類號 S813.3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）13-03926-04

Abstract Several essential kinds of proteins related to the molecular regulation of mammalian embryonic development were reviewed， as well as effects of cryopreservation on embryonic development at the molecular level.

Key words Mammalian； Cryopreservation； Embryonic development； Molecular regulation

近年來，由于胚胎冷凍技術的不斷進步，已成為一項成熟的胚胎工程技術，甚至克隆胚胎通過冷凍技術也獲得了相應的后代[1]。盡管如此，胚胎冷凍的機理尚不十分清楚。除了冷凍保護劑的毒性、冷凍損傷、細胞內冰晶的形成等因素對胚胎產生影響外，冷凍本身可使胚胎內的一些固有結構、物質（如mRNA）發生改變[2]，嚴重影響胚胎的存活率。冷凍/解凍后胚胎的基因表達分析可能是一種有效揭示這類胚胎早期發育分子機制的有效途徑。

1 哺乳動物胚胎發育過程中相關的重要蛋白質

在哺乳動物早期胚胎發育過程中，細胞內物質的變化錯綜復雜。早期胚胎的發育是由卵母細胞中的一些因子來調控的，這些因子是在卵母細胞發育過程中合成和存儲的。在胚胎基因組活性激活以前，胚胎的發育是由這些因子來調節的。胚胎形成后，基因組的轉錄和表達才被啟動，胚胎的發育逐漸由自身合成的物質來調控。

1.1 DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase）

目前，在哺乳動物中已發現4種DNA甲基轉移酶（Dnmts），根據結構和功能的差異分為兩大類：分別以Dnmt1和Dnmt3為代表。前者主要用于保持子代細胞與母細胞相同的DNA特異性甲基化模式，參與甲基化狀態的維持，也是非CpG位點從頭甲基化所必需的，并與甲基化狀態的延伸有關；后者包括Dnmt3a、Dnmt3b以及Dnmt3L等，主要負責建立胚胎發育分化過程中的組織特異性甲基化模式，是主要的從頭甲基化酶[3]。Dnmt對早期胚胎的正常發育至關重要[4-5]。

在不同的序列類別中，哺乳動物的DNA甲基化對基因的轉錄活性是一種主要和關鍵的表觀遺傳調節機制（Epigenetic regulatory mechanism）。在小鼠的生殖細胞發育過程中，從頭甲基化只在非常有限的時期發生，說明Dnmt3a和Dnmt3b在限制功能的表達有一定的機制作用[6]。分析Dnmt3a還能確定表觀遺傳重編程（Epigenetic reprogramming）的潛能差異[7]。Dnmtl蛋白在胚胎發育時建立組織特異性甲基化模式方面發揮重要作用，在正常發育的胚胎中維持一種正確的DNA甲基化模式需要Dnmt1地正確表達和發育階段特定的翻譯后調節[8]。在綿羊的生發泡（Germinal vesicle，GV）期卵母細胞及早期胚胎發育過程中，GV期卵中Dnmt1 mRNA含量最高，從2-細胞胚胎開始直至囊胚，Dnmt1基因的mRNA含量顯著降低，Dnmt1的含量在不同發育階段的卵母細胞和胚胎中存在動態變化，這對卵子生長和胚胎發育具有重要意義[9]。

1.2 縫隙連接蛋白（Connexins）

此類蛋白是細胞間建立縫隙連接所必需的。在研究胚胎致密化的分子調控時發現，牛體內胚胎在桑椹胚期可檢測到connexin43（Cx43）的表達[10]，體外生產的牛胚胎有的不表達這類蛋白，導致胚胎不能致密化，無法形成桑椹胚[11]，從而降低胚胎潛能性。在綿羊卵母細胞和早期胚胎發育過程中，connexin26、connexin32、Connexin43及Connexin45在各個時期均有表達，Cx43在未成熟卵母細胞、體外成熟（IVM）卵母細胞、2-細胞中表達量較低，桑堪胚和囊胚期時達到最高；而Cx45在8-細胞期表達量最高，未成熟卵母細胞、IVM卵母細胞和2-細胞期的表達量低于8-細胞期，桑堪胚和囊胚期胚胎的表達量稍低于8-細胞期；Cx43和Cx45蛋白在體內受精胚胎中轉錄子的含量高于體外受精（IVF）胚胎[12]。Cx43基因在水牛IVM卵母細胞中表達量最高，顯著高于IVF 2-細胞期胚胎、桑椹期胚胎、囊胚期胚胎[13]。

1.3 上皮鈣調素蛋白（Epithelial cadherin，E-cadherin）

調節上皮細胞間粘連的重要蛋白，其功能的發揮需要Ca2+的參與。在研究胚胎致密化及細胞間連接的分子調控時發現，E-cadherin是桑椹胚外層細胞或囊胚滋養層細胞間緊密連接復合體形成的主導因子，胚胎致密化或囊胚的形成主要依賴于此蛋白。如果這種蛋白質缺失或其功能達不到正常發揮，胚胎在桑椹胚或囊胚期的發育就會出現異常[14]，導致胚胎不能進入下一發育階段。在水牛IVM卵母細胞及IVF早期胚胎發育過程中，E-cad基因在各個時期中mRNA表達無顯著差異[13]。

1.4 緊密連接蛋白（Tight junction protein）

研究表明外層細胞間的緊密連接至少是由5種蛋白構成的復合體，它們分別是ZO-1、ZO-2、7H6、扣帶蛋白和封閉蛋白。封閉蛋白是核心成員之一，它與ZO-1和扣帶蛋白結合在一起構成細胞外連接和細胞內骨架間的結合鏈，使胚胎內細胞之間緊密連接起來。ZO-1是構成細胞間連接的主要成分，在小鼠和牛胚胎外層細胞的連接部位，呈點狀分布[14]。外層細胞的緊密連接在胚胎發育過程中具有重要功能：調節相鄰細胞間的物質運輸；維持外層細胞的極性；維持Na/K-ATP酶的極性分布；維持半透膜的穩定性，防止過度膨脹[15]。

1.5 干擾素-τ（Interferonτ，IFN-τ）

IFN-τ是一種孕體分泌蛋白，在反芻動物的整個妊娠失敗中早期胚胎死亡占有很大的比例，它在很大程度上是由母體妊娠識別失敗造成的。IFN-τ是由反芻動物孕體附植時發出的特有的妊娠識別信號，是建立母體妊娠識別的一種主要因子。另外，IFN-τ在免疫方面也起著重要作用。

牛胚胎在體外生長發育過程中，IFN-τ在胚胎發育的各個時期均有表達，除在未成熟卵母細胞中呈高表達外，其余都呈低表達，這與其維持黃體功能密切相關[16]。Rho G J等也研究表明IFN-τ在胚胎發育的各個時期均有表達[17]。然而，也有研究表明IFN-τ mRNA在牛IVF第4天的16-細胞胚胎期、體細胞核移植（Somatic cell nuclear transfer，SCNT）第5天的桑椹期、孤雌激活（Parthenogenetic activation，PA）第6天的早期囊胚期首次表達[18]。

1.6 熱休克蛋白（Heat shock proteins）

哺乳動物中廣泛存在一類熱應急蛋白質。當有機體暴露于高溫時，就會由熱激發合成此種蛋白，來保護有機體自身。許多熱休克蛋白具有分子伴侶活性。按照蛋白的大小，熱休克蛋白共分為5類，分別為Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60 以及小分子熱休克蛋白（Small heat shock proteins，sHSPs）。

在牛胚胎體外生長發育過程中，Hsp70在胚胎發育的各個時期均有表達，但表達量稍低[16]。1999年C.WRENZYCKI等在對牛體外胚胎進行培養時，發現添加血清的培養液獲得的早期胚胎比添加聚乙烯醇（PVA）的培養液獲得的早期胚胎的潛能性更高，差異顯著，同時，在2個試驗組中均發現Hsp70持續表達，且添加血清的比添加PVA的試驗組顯著增加[19]，表明Hsp70的表達量與體外生產的胚胎質量成正相關。Mishra A等研究也發現Hsp70在胚胎發育的各個時期均有表達，但在發育緩慢的胚胎中Hsp70的表達量較少，8-16細胞期后幾乎不表達；它與溫度緊密相關，隨著溫度的增加，Hsp70 mRNA的表達量也相應提高，說明Hsp70 mRNA的表達可能作為胚胎對溫度敏感性的靶標[20]。

1.7 葡萄糖轉運蛋白（Glucose transporters）

此類蛋白與細胞代謝有關。2002年Knijn等研究表明牛體內受精獲得的囊胚期胚胎

Glut-1表達量顯著高于體外獲得的囊胚期胚胎[21]。在牛胚胎體外生長發育過程中，Glut-1基因一直持續高表達，這與體外培養的胚胎生長發育狀況密切相關[16]。

Rajhans R等研究也發現Glut-1在水牛體外生產胚胎發育的各個時期均有表達，但在發育緩慢的胚胎中Glut-1的表達量較少，8-16細胞期后幾乎不表達，說明Glut-1的表達與胚胎發育阻滯密切相關[22]。2010年J. Zaraza等研究表明Glut-3在8-細胞、16-細胞時期表達水平低，囊胚期表達量增加，說明葡萄糖轉運蛋白對囊胚期胚胎是非常必需的[23]。哺乳動物附植前胚胎能輕易地吸收及利用葡萄糖，葡萄糖轉運蛋白發揮了很大作用。另外，有研究發現Glut1、Glut3、Glut8在胚胎發育早期各個時期均有表達，而Glut2僅在囊胚期開始表達[24]。

1.8 細胞凋亡相關蛋白

細胞凋亡是細胞的一種基本生物學現象，在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中起著必要的作用。細胞凋亡是個體發育過程中由一系列蛋白調控的細胞主動死亡過程。其中，bcl-2家族、caspase家族、p53蛋白、survivin蛋白都是重要的凋亡調節因子，在細胞凋亡中相互聯系，相互作用，從而調控細胞凋亡。

研究發現高濃度葡萄糖可誘導小鼠囊胚細胞凋亡相關基因Caspase-3的表達，其表達在內細胞群尤其明顯，并伴有囊胚細胞數目明顯減少，從而證實高濃度葡萄糖對胚胎的毒性作用在胚胎著床前已經發生[25]。Bcl-2基因通過阻止抑制細胞凋亡直接調控正常免疫器官的發育， 在淋巴細胞發育過程中Bcl-2是免疫細胞亞型選擇的重要調節物[26]。在小鼠體內早期胚胎發育過程中，隨著胚胎細胞數目的增加，凋亡比率逐漸增大；Bax表達量在整個過程中基本不變，Bcl-2表達量逐漸上調，Bak、Bcl-xl的表達量逐漸降低[27]。2008年H.Y.Jang等用牛輸卵管上皮細胞（BOEC）與胚胎共培養時，發現不管是共培養獲得的早期胚胎還是單獨培養得到的早期胚胎，均檢測到Caspase-3和Bax基因，然而p53基因只在與BOEC共培養的胚胎中被檢測到[28]。2006年Boon Chin Heng等研究表明細胞凋亡而不是細胞壞死是降低冷凍/解凍后的人類胚胎干細胞（hES）生存能力的主要機制，此hES是用傳統冷凍法冷凍保存的[29]。

2 超低溫冷凍對胚胎的分子調控研究現狀

2007年Dhali等采用微滴玻璃化冷凍法（Droplet vitrification）冷凍小鼠囊胚期胚胎時，發現冷凍后的胚胎與鮮胚相比，Bax、Bcl-2和p53 3個基因轉錄物相對量均下降，同時凍胚的發育潛能力比鮮胚低，表明此3種基因轉錄物與胚胎發育潛力有很大的聯系[30]。然而，2010年Kuzmany等研究牛胚胎的冷凍時發現，與冷凍前的胚胎相比，冷凍后胚胎中的Bax及Bcl-XL轉錄物相對量均顯著增加，說明超低溫冷凍對胚胎內細胞凋亡的相關基因轉錄物同樣有影響[31]。2011年Anna Kuzmany等也發現，與體外培養獲得的牛鮮胚相比，冷凍后囊胚中的Bax、Bcl-XL基因表達顯著上調（Up-regulation），結果表明冷凍后的胚胎已經開啟mRNA合成，為下一步胚胎發育做準備[32]。2012年Lisa Shaw等研究超低溫冷凍對人早期胚胎的基因表達時發現，與鮮胚相比，冷凍組的4-細胞胚胎與囊胚Bax表達顯著上調[33]。

2006年Sae Young Park等用2種不同玻璃化冷凍法（0.25 ml麥管開放式拉管法和最小容積法）對牛囊胚進行冷凍試驗，發現survivin、Fas、caspase-3及Hsp70的表達水平較非冷凍組顯著增加，表明冷凍程序可能導致胚胎損傷，從而引起DNA破裂且細胞凋亡相關基因轉錄物也隨之增加，最終降低了冷凍胚胎的發育潛能[34]。2010年Kuzmany等研究也表明，與冷凍前相比，冷凍后擴張囊胚（Reexpanded blastocysts）中的HSPA1A mRNA顯著增加[31]；與牛IVP正常胚胎相比，玻璃化法和傳統冷凍法使孵化囊胚中的HSP70轉錄物的相對量受到明顯影響，揭示不同冷凍方法對牛孵化囊胚中的重要基因表達量具有很大影響[35]。 2011年Stinshoff等用傳統冷凍法與玻璃化冷凍法對牛擴張囊胚期胚胎進行冷凍保存時，發現用玻璃化法的HSPA1A與鮮胚組存在顯著差異，用傳統冷凍法的HSPA1A與鮮胚組相比也存在顯著差異，而玻璃化法（Vitrification）比傳統冷凍法（Conventional slow freezing）更適合于保存胚胎[36]。2011年Anna Kuzmany等研究時發現，與體外培養獲得的牛囊胚期鮮胚相比，冷凍后的囊胚中Hsp 1A的轉錄物顯著地上調[32]。

與 IVP 的正常牛孵化囊胚相比，用玻璃化法和傳統冷凍法冷凍后的孵化囊胚中GLUT-1轉錄物的相對量受到明顯影響，用傳統冷凍法冷凍后的孵化囊胚中的GLUT-3 mRNA量也受到顯著影響，結果表明冷凍處理過程本身及冷凍方法對牛孵化囊胚中的重要基因的表達有很大影響[35]。2011年Stinshoff等發現用玻璃化法冷凍后的擴張囊胚中Glut-1表達豐度與鮮胚存在顯著差異，用傳統冷凍法冷凍后的Glut-1、 Glut-3與鮮胚組也存在顯著差異，揭示玻璃化法比傳統冷凍法更適合于保存胚胎[36]。

在研究胚胎致密化及細胞間連接的分子調控時發現，與 IVP 正常牛孵化囊胚相比，用玻璃化法和傳統冷凍法冷凍后的孵化囊胚中ZO-1轉錄物的相對量明顯受到影響，同時發育潛能也降低[35]。與正常鮮胚相比，傳統冷凍法冷凍后的孵化囊胚中DNMT3a mRNA量受到顯著影響[35]。2011年Stinshoff等發現用傳統冷凍法冷凍后的胚胎中DNMT3a mRNA相對豐度與鮮胚組相比也存在顯著差異[36]。對干擾素的研究發現傳統冷凍法冷凍后的牛孵化囊胚中的IFN-τ mRNA量受到顯著影響[35]。2011年Stinshoff等也發現用傳統冷凍法冷凍后的牛胚胎IFN-τ mRNA量與鮮胚對照組存在顯著差異，此外玻璃化法與傳統冷凍法相比IFNT2基因轉錄物也存在顯著差異[36]。

3 小結

綜上所述，超低溫冷凍保存對哺乳動物體外生產胚胎質量的影響在分子水平上清楚地得到反映。在胚胎冷凍過程中，研究表明盡可能保證及維持早期胚胎基因組的正常表達，凍融胚胎的潛能性就可以得到提高，從而可以依此判斷冷凍方法的可行性及高效性。從分子水平上來分析胚胎的質量，可為拯救瀕危動物和開發利用珍稀動物及解決基因克隆的低效率問題提供技術參考。隨著分子檢測技術的不斷提高，胚胎質量的鑒定也會更加方便準確，胚胎冷凍損傷機制也將得到進一步闡釋。

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