利用RAPD標記分析咖啡種質資源的遺傳多樣性

黃麗芳 董云萍 王曉陽 陳鵬 林興軍 范睿 閆林

摘 要 通過引物篩選獲得18條RAPD多態性引物，利用該引物對72份咖啡種質資源進行RAPD擴增，共擴增出149條條帶，其中多態性條帶126條，多態性位點為84.6%。運用UPGMA方法構建了聚類圖，在相似系數0.632的水平下可將72份資源聚為3個大類，其中A類群包含了所有的中粒種資源（Coffea canephora Pierre）及一份由云南德宏所選育的中小粒種雜交種（阿拉伯斯塔），共34份咖啡種質資源；B類群包括了6份查理種（Coffea excelsa Chevalier）和大粒種（Coffea liberica Bull ex Hiern）；C類群由小粒種（Coffea arabica. Linne）咖啡組成。結果說明咖啡種質的遺傳關系種間容易劃分，在種的分類水平上存在遺傳關系多樣性，部分資源的分類學地位與地理來源無相關性。

關鍵詞 咖啡；RAPD；遺傳多樣性

中圖分類號 S571.2 文獻標識碼 A

咖啡與可可、茶同列世界三大飲料作物，其主要栽培品種為小粒種（C. arabica L .）和中粒種（C. canephora Pierre）。另外的2個品種大粒種（C. liberica Bull ex Hiern）和查理種（C. excelsa Chevalier），因品質較差，很少作為商業栽培。目前，咖啡已是許多地區經濟發展的支柱產業[1]。國內咖啡主產區在云南和海南，已在中國熱帶農業科學院香料飲料研究所及云南德宏熱帶農業科學研究所建立了咖啡種質圃，收集了從墨西哥、喀麥隆、馬來西亞等地引進的咖啡種質200多份。因種質資源多為外引的栽培品種或大田選擇的變異單株，因而種質資源相對匱乏，遺傳基礎狹窄，且中國對咖啡種質的鑒定評價研究較淺，還未開展對咖啡種質資源遺傳特性的研究，致使咖啡新品種選育速度緩慢。

分子標記是一種快速高效的遺傳分析方法，可有效排除環境因素和觀察標準的誤差。國外利用RAPD、AFLP、SRAP、SSR和EST-SSR等技術針對小粒種或中粒種咖啡進行主栽品種、雜交群體的遺傳特性、遺傳關系以及品種的鑒定[2-5]。中國學者莫饒[6]用11對SSR引物構建了12份咖啡品種的SSR指紋圖譜，但許多品種資源的分類地位及親緣關系尚不清楚，不利于進一步利用現有資源開展育種工作。

隨機擴增多態性DNA標記（random amplified polymorphic DNA， RAPD），是研究遺傳多樣性的有力工具，比AFLP、SRAP操作簡便、快捷、成本低，比SSR產物多態性豐富，具有擴增多態性好，靈敏度高，對DNA序列不要求了解等優點[7-10]。RAPD標記不足之處就是受反應條件影響較大，檢測的重復性較差，使得不同研究者的研究結果難以比較，但可以通過建立一個穩定性好、重復性高的RAPD-PCR反應體系進行優化，以及反復試驗，選擇重復性好的條帶錄入數據，即可克服重復性差的弱點，增加試驗的可靠性[11]。Anthony等[12]利用RAPD標記研究了埃塞俄比亞咖啡起源中心代表88份種質的119株小粒種咖啡的遺傳多樣性，用29個多態性片段計算相似性指數和構建“樹狀圖”。本研究對收集到的72份咖啡資源進行遺傳多樣性研究，利用RAPD技術分析了咖啡種質資源親緣關系，為鑒定咖啡種質資源遺傳性狀、篩選適宜的雜交親本、核心種質的建立提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

72份咖啡種質資源見表1，其中中粒種資源32份，小粒種32份，大粒種3份，查理種3份，中小粒種雜交種1份，還有1份來自福建的資源分類不明確。編號1-61，67-72取自中國熱帶農業科學院香料飲料研究所咖啡種質資源圃（海南興隆），其中編號1-19為該所選育的高產無性系，編號62-66取自海南省澄邁縣。72份材料分別來源于中國云南、海南等5省份，以及喀麥隆、墨西哥等11個國家。試驗于2012年在農業部香辛飲料作物遺傳資源利用重點實驗室進行，選取健康植株上的無病蟲害成熟葉片，液氮速凍后于-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 基因組DNA的提取參照黃麗芳等[13]的CTAB改良法。提取的基因組DNA經1.0%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計檢測質量，稀釋至20 ng/μL，置于-20 ℃保存備用。

1.2.2 引物篩選及RAPD擴增 選取RAPD引物S1-S100共100條隨機引物。利用4份差異較大的咖啡（27號、臺灣小粒、大粒、M10）模板進行引物篩選，選取多態性好且擴增條帶清晰的引物用于本試驗。使用郎基LK200梯度PCR儀進行RAPD反應，PCR反應體系為本課題組優化過的咖啡RAPD反應體系[14]：基因組DNA 20 ng，dNTPs 0.3 mmol/L，Taq酶1.25 U，Mg2+ 1.5 mmol/L，引物0.6 μmol/L，10×buffer 2 μL，雙蒸水補足20 μL。PCR反應程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，38 ℃ 1.75 min，72 ℃延伸2 min，40個循環；72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。PCR產物加入3 μL溴酚藍，1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，試驗重復2次。

1.3 數據分析

根據引物擴增產物在瓊脂糖凝膠中遷移率的不同，對電泳結果統計。相同遷移位置，重復性、清晰度好的擴增條帶賦值“1”，無條帶或肉眼不易分辨的弱帶賦值“0”，采用NTSYSpc 2.1軟件，根據Nei和Li相似系數計算遺傳相似系數GS（genetic similarity），根據非加權算術平均法（UPGMA）進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 RAPD引物篩選與擴增片段多態性

通過4份性狀差異較大的咖啡品系擴增（圖1），從100條RAPD隨機引物中篩選出18條多態性好且擴增條帶清晰的引物。

利用篩選出的18條引物對72份咖啡材料進行RAPD擴增，共擴增得到149條DNA條帶（表2），多態性帶126條，占所觀察到總擴增帶的84.6%。不同引物擴增獲得的多態性條帶數量在4～12條之間，平均每個引物擴增出7條多態性條帶，各條引物檢測到的多態性條帶比例為62.5%～100%，擴增條帶分子量多數為500～1 800 bp。其中引物S19擴增出12個位點的條帶，擴增條帶數最多，多態性比率為100%（圖2）；引物S25、S28、S46、S75擴增總帶數最少，為6條。

2.2 遺傳相似系數

72份咖啡資源的遺傳相似系數在0.364 4～0.974 6之間。根據遺傳相似系數可知不同種質親緣關系的遠近，從表3可以看出，所有種質間均有不同程度的遺傳差異。興33和云南貢山-2的遺傳相似系數最小（0.364 4），表明遺傳距離最遠，遺傳差異最大；興2小粒種和CTM19的遺傳相似系數最大（0.974 6），表明遺傳距離最近，遺傳差異最小。同一種質資源內個體間也存在不同程度的差異，其中石壟坡個體間差異最大，個體間平均遺傳相似系數為0.529 7，個體間最小遺傳相似系數為0.423 7，最大遺傳相似系數為0.923 7。而卡蒂莫（巴西）個體間差異最小，平均遺傳相似系數為0.679 7，個體間最小遺傳相似系數為0.432 2，最大遺傳相似系數為0.957 6。

2.3 聚類分析

聚類分析顯示，在相似系數0.632水平下，全部材料可以分為3大類，A類群包括來自海南興隆、越南、巴布亞新幾內亞、馬來西亞、泰國、印尼、福建的全部中粒種資源，以及一份由云南德宏所選育的中小粒種雜交種（阿拉伯斯塔），共34份咖啡種質資源；B類群包括了來自海南文昌和興隆的6份查理種和大粒種；C類群包括了來自巴西、墨西哥、馬來西亞、印度、喀麥隆、哥倫比亞、葡萄牙、廣西、云南德宏、海南的32份小粒種咖啡（圖3）。

A類群由全部供試的中粒種種質組成，在相似系數為0.675時，一份來自福建的種質單獨成為一分支，其他的33份資源在0.726為相似系數時又分為兩個支，來自海南興隆、越南、馬來西亞、泰國等地的咖啡資源聚為一類，阿拉伯斯塔、印尼及一份來自巴布亞新幾內亞的資源聚為另一類。

B類群的種質受來源地的影響較為顯著，遺傳相似系數范圍為0.705～0.958。在0.915為截值時，來自海南文昌的南頂、大粒種和石壟坡聚為一類，與查理小果、查理大果在0.871截值時聚為一個分支，而查理中果則在0.705時與其他5份種質進行聚類。

C類群包含了全部的小粒種咖啡，在相似系數0.748時，分為2個分支，其中一支有來自臺灣南部、臺灣中部、云南貢山-1和云南貢山-2，共4份種質；另一分支有來自巴西、喀麥隆、廣西等地共28份種質。

3 討論

通過分析發現，72份咖啡資源分為3大類，相似系數0.364 4～0.974 6之間，說明這些材料遺傳基礎相對較寬，存在較大的遺傳變異性。

A類群遺傳相似系數范圍在0.675～0.898之間，種內遺傳多樣性較豐富，遺傳背景較復雜。這可能與中粒種咖啡是異花授粉有關，在長期的繁殖過程中，產生并積累了大量的不連續變異。Hamrick等[15]經過研究發現，多年生異花授粉植物具有較高水平遺傳多樣性，在種內水平上這種現象尤為明顯。

Anthony等[16]用37對AFLP引物和6對SSR引物研究了26份栽培和半野生小粒種的遺傳多樣性，結果表明，AFLP和SSR的聚類情況相似，半野生小粒種的多態性較栽培種的高，但總體的遺傳基礎較窄，本研究中也發現，小粒種咖啡的親緣關系較緊密，遺傳相似系數為0.748～0.974，遺傳多樣性不明顯。聚類分析表明，A、B、C類群種間關系清晰，查理種、大粒種、中粒種及小粒種聚類得到的結果與經典分類結果較為一致。

咖啡資源的遺傳關系與資源來源地有關，與植物學分類學特性、長期的人工種植、栽培環境、果實的大小、用途等[17-20]具有一定的相關性。72份資源的聚類結果表明，不同國家（地區）咖啡資源有聚在一起的趨勢，但也有材料偏離所屬國家（地區）的現象，如C類群的小粒種資源，臺灣南部、臺灣中部和云南貢山的2份資源聚為一個分枝，而臺灣小粒種在另一分枝，差異較大，說明同一地區的種質間存在遺傳差異。導致劃分的類群與其來源地相關性不明顯的原因，可能是廣泛的種質起源以及漫長的進化，也可能是長期人工選育的結果[21]。

本研究發現咖啡的遺傳關系若僅由種質材料來源區域的遠近和生產上品種的名稱、外形來判斷無疑難以得到確切的分類信息。通過RAPD標記分析結果表明，72份咖啡資源存在遺傳差異，種間容易劃分，但在種內分類水平上，小粒種遺傳關系較緊密，多樣性不明顯，而中粒種咖啡遺傳多樣性豐富，與小粒種咖啡有明顯的區別。此外，研究還表明部分咖啡資源的遺傳關系與其地理來源并無相關性，這也反映了咖啡產地對其分類學地位的影響不顯著。

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責任編輯：趙軍明