繡球菌多糖的提取及對果蠅壽命的影響

趙志強等

摘要 [目的]研究繡球菌多糖對果蠅壽命的影響。[方法]采用熱水浸提法從繡球菌中提取多糖，并采用三氯乙酸法對多糖進行純化，并研究繡球菌多糖對果蠅壽命的影響，為繡球菌的開發利用提供試驗依據。[結果]熱水浸提法提取的粗糖含量與得率分別為47.6%和15.26%；三氯乙酸法純化后的多糖含量與得率分別為58.3%和7.7%。在0.2～5.0 g/L時，繡球菌多糖能延長果蠅的壽命和半數死亡時間。當繡球菌水溶粗多糖在0.2 g/L時，雄果蠅平均壽命延長26.6%，半數死亡時間為（46.4±2.6）d，最高壽命為（55.7±1.8）d，雄果蠅的壽命延長率最大。[結論]繡球菌多糖對果蠅的壽命有延長作用，對雄性的抗衰老效果好于雌性。

關鍵詞 繡球菌；多糖；果蠅；抗衰老

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）13-03863-02

Abstract [Objective] To study the effect of Sparassis crispa polysaccharide on the lifespan of Drosophila melanogaster and provide the experimental basis for the development and utilization of sparasis crispa. [Methods] The hot water extraction was used to extract polysaccharide and trichloroacetic acid method was used to purify polysaccharide. [Results] The hot water extraction was used to obtain coarse polysaccharide， its sugar content and yield were 47.6% and 15.26%； the content of polysaccharide purified and yield were 58.3% and 7.7% respectively. At 0.2-5 g/L， Sparassis crispa polysaccharide can prolong the life of Drosophila and half of the time of death. When the water soluble crude polysaccharide of Sparassis crispa is 0.2 g/L， the male Drosophila melanogaster can extend the average lifespan of 26.6%， median survival time was 46.4 ± 2.6 days， and 55.7 ± 1.8 days for maximum lifespan， showing the highest extension rate of male Drosophila melanogaster. [Conclusion] Sparassis crispa polysaccharide can extend lifespan of Drosophila melanogaster， and the effect on male Drosophila melanogaster is better than on female one.

Key words Sparassis crispa； Polysaccharide； Drosophila melanogaster； Antiaging

繡球菌（Sparassis crispa Fr.）屬無隔擔子菌亞綱無褶菌目繡球菌科繡球菌屬，是一種非常珍稀名貴的食藥用菌[1]。多糖是繡球菌重要的活性成分，具有免疫調節、抗腫瘤、降血糖和降血脂等藥理活性[2-4]。目前，對于繡球菌多糖抗衰老活性的研究鮮有報道。筆者采用水煮醇沉法提取繡球菌多糖[5-7]，并研究其對果蠅的抗衰老活性，以期為繡球菌資源的開發利用提供可靠數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

研究對象。繡球菌，購自浙江磐安山村儂農特產有限公司，粉碎，過40目篩，備用。

1.1.2

主要儀器。PDZ5-WS低速多管架自動平衡離心機，購自長沙湘儀離心機儀器有限公司；752N紫外可見分光光度計，購自上?？茖W精密儀器廠；HHS型電熱恒溫水浴鍋，購自上海博迅實業有限公司醫療設備廠；BS 124S電子天平，購自北京賽多利斯儀器系統有限公司；PHS-25型數顯酸度計，購自上海天達儀器有限公司；DHG-9245A電熱恒溫鼓風干燥箱，購自上海一恒科學儀器有限公司；Galanz WD800G微波爐，購自佛山市順德區格蘭仕微波爐電器有限公司；HPP-9162恒溫培養箱，購自北京東聯哈爾儀器制造有限公司。

1.1.3

主要試劑。95%乙醇、無水乙醇、乙醚、葡萄糖、三氯乙酸、濃硫酸、苯酚、瓊脂、蔗糖、玉米粉、丙酸和酵母粉的奶粉所有試劑均為分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1

粗多糖提取。繡球菌子實體粉末→加水溶脹過夜→水浴提取2次、2 h/次→離心→合并上清→濃縮→3倍體積乙醇醇沉過夜→離心→沉淀加無水乙醇、乙醚洗滌→離心→沉淀常規干燥→即得水溶粗多糖。

1.2.2

粗多糖純化。精確稱量水溶粗多糖，用蒸餾水配制成5%糖液。加入濃度10%三氯乙酸調節其pH值至3，靜置過夜，離心（3 000 r/min，10 min）上清中加入4倍體積的濃度95%乙醇再靜置過夜，離心，沉淀加入無水乙醇、乙醚洗滌，真空干燥器中干燥，即得水溶、堿溶和酸溶去蛋白多糖。

1.2.3

多糖含量測定。（1）葡萄糖標準曲線的制定見參考文獻[8]。（2）多糖含量的測定。采用苯酚-硫酸法。精確稱量水溶多糖5 mg，分別定容至50 ml容量瓶中備用。各取1 ml于相應的試管中，采用苯酚-硫酸法，在490 nm波長處測定吸光度，用回歸方程計算出樣品中多糖含量和得率，多糖得率（%）=粗多糖含量/原料重量×100。

1.2.4

多糖活性的研究。（1）果蠅培養基的配置[9]。先將瓊脂加熱溶解，再溶入蔗糖，然后慢慢加入玉米粉，邊加邊攪拌，成為糊狀后停火，待溫度稍微下降后，加入丙酸，充分攪拌后立即分裝于潔凈的培養瓶中，待培養瓶瓶壁晾干后在培養基表面撒一層酵母待用，培養溫度為25 ℃。將提取到的粗多糖和純多糖分別以不同的濃度置入基本培養基中，代替蔗糖，其他方法同上，每個批次重復3次。（2）繡球菌多糖對果蠅壽命的影響。將成熟果蠅裝入有基礎培養基的50 ml三角瓶內交配產卵，形成蛹時除去親本蠅，收取10 h內羽化的果蠅，用乙醚將其麻醉后，分出雌雄，挑取體型大小相近的果蠅進行分組。將選取好的雌雄果蠅平均置入基本培養瓶和含有不同濃度繡球菌多糖的培養瓶中，每個培養瓶放入15只果蠅，雌雄分瓶培養。多糖組的果蠅在基礎培養基中培養到第14天后，轉到含不同濃度多糖提取物的培養基中培養直至其全部死亡。試驗在溫度（25±1） ℃、相對濕度50%～70%的培養箱內進行，每隔4 d 更換新鮮的培養基。每天定時統計果蠅死亡數直至果蠅全部死亡。試驗結束后計算每組的平均壽命、半數死亡時間和最高壽命。數據用SPSS軟件統計，采用單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 繡球菌多糖含量與得率的測定

精確稱取10.00 g繡球菌粉末，采用熱水浸提法提取繡球菌多糖。通過三氯乙酸法脫蛋白后，得去蛋白水溶多糖。根據苯酚-硫酸法，得葡萄糖回歸方程為：Y=0.009 4X+0.019 （R2=0.997 5）。由表1可知，繡球菌水溶多糖含量隨著三氯乙酸法脫蛋白后有所增加，而多糖得率卻減少。

3 結論

不同濃度的繡球菌水溶粗多糖與去蛋白多糖對果蠅的壽命均有延長作用，繡球菌多糖對雄果蠅壽命延長的效果高于雌性，這可能與動物的壽命存在差異有關[10]。試驗結果發現，繡球菌多糖濃度為0.2 g/L的情況下對果蠅壽命延長效果最佳，水溶粗多糖對雄性果蠅的半數死亡率延長效果最好，去蛋白水溶多糖對雌性果蠅的半數死亡率延長效果最好；并且隨著多糖濃度的增加，延長果蠅壽命的效果呈下降趨勢。因此，繡球菌多糖對果蠅具有抗衰老的作用，為開發利用繡球菌多糖提供了試驗依據。

參考文獻

[1] 薛道帆，周立平，何傳俊，等.繡球菌的研究開發概況[J].杭州農業科技，2008（3）：27-29.

[2] 朱斗錫，何榮華.珍稀名貴繡球菌的經濟價值及開發前景[J].食用菌，2008（3）：8.

[3] 王曉娟，魏傳晚，徐淑永，等.生物活性多糖結構與功效關系的研究進展[J].廣州化工，2004，32（1）：6-10.

[4] 李小定，榮建華，吳謀成，等.真菌多糖生物活性研究進展[J].食用菌學報，2002，9（4）：50-58.

[5] 徐翠蓮，杜林洳，樊素芳，等.多糖的提取、分離純化及分析鑒定方法研究[J].河南科學，2009，27（12）：1524-1529.

[6] HUANG G L，CHEN Y，WANG X Q.Extraction and deproteinization of pumpkin polysaccharide[J].International Journal of Food Sciences and Nutrition，2011，62（6）：568-571.

[7] 張一帆，張智，魏志艷，等.四種方法提取靈芝粗多糖的得率比較試驗[J].食用菌，2010（6）：58-60.

[8] 毛慧玲，束盈慧，葉子堅，等.茶樹菇多糖提取方法[J].南昌大學學報：理科版，2006，30（1）：49-51.

[9] 王貴民，董振紅，郝再彬.甜葉菊糖苷對果蠅生長和繁殖的影響[J].昆蟲知識，2009，46（1）：129-132.

[10] 蘭瑛，潘志福，張松，等.尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對果蠅壽命的影響[J].中國食菌，2010，29（4）：43-45.