南方地區(qū)無核葡萄胚挽救及其取樣時(shí)間研究

梅軍霞等

摘要 [目的]探討無核葡萄品種離體培養(yǎng)的培養(yǎng)條件，并確定最佳取樣時(shí)期。[方法]選取南方無核葡萄品種中5個(gè)自然授粉胚珠和4個(gè)雜交組合的胚珠為試材，通過形態(tài)學(xué)觀察確定取樣時(shí)間，探索適宜南方無核葡萄品種的胚挽救程序。[結(jié)果]適宜火焰無核×寒香蜜、碧香無核、火焰無核、奧迪亞無核等的胚挽救程序?yàn)槭诜酆?0～40 d剝?nèi)∨咧榻臃N在ER培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)90 d，取胚轉(zhuǎn)入WPM培養(yǎng)基上成苗。[結(jié)論]該研究可為提高幼胚離體發(fā)育和萌發(fā)成苗率提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 無核葡萄；胚挽救；取樣時(shí)間

中圖分類號 S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）13-03842-02

Abstract [Objective] The aim was to discuss the in vitro cultivation conditions of seedless grape and confirm on the best sampling time. [Method] Choosing five kinds of natural pollination and four hybrid combinations of southern seedless grape as materials， the sampling time was identified by morphological observation and the suitable embryo rescue progress for southern seedless grape was explored. [Result] The suitable embryo rescue progress for Flame Seedless×Hanxiangmi， Bixiang Wuhe， Flame Seedless， Otilia Seedless was that the embryos were first inoculated at 30-40 days after fertilization， and then developed on the ER medium for 90 d， the embryos were cultured on WPM medium for germination. [Conclusion] The study provides a scientific basis for improving embryos development in vitro and germination rate.

Key words Seedless grape； Embryo rescue； Sampling dates

由于無核葡萄沒有種子，不能作為母本獲得雜交后代植株，只能利用有核品種作為母本與其雜交，但其后代出現(xiàn)無核植株的比率很低，且育種周期較長。研究表明，85%以上的無核葡萄為假單性結(jié)實(shí)，即種子敗育型，雖然經(jīng)過受精，但受精后的胚很快停止發(fā)育導(dǎo)致無核。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，葡萄胚挽救技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，在一定程度上解決了無核葡萄育種的難題。近年來，關(guān)于葡萄胚挽救的研究逐漸為葡萄育種學(xué)家重視，其影響因子的研究以及胚挽救體系的建立日趨成熟。金釗等研究表明，影響胚挽救萌發(fā)率的最關(guān)鍵因素為接種時(shí)間[1-3]。而關(guān)于胚挽救的報(bào)道多出自北方，南方由于高溫高濕的氣候環(huán)境被列為葡萄非適宜和次適宜種植區(qū)，品種中晚熟居多，且缺少無核品種。因此，利用現(xiàn)代科技技術(shù)開展早熟、無核葡萄育種，提高育種水平，完善品種結(jié)構(gòu)，才能確保南方葡萄產(chǎn)業(yè)的全面可持續(xù)發(fā)展。為此，筆者通過形態(tài)學(xué)觀察研究胚敗育過程，確定各品種取樣時(shí)間，同時(shí)探索適宜南方無核葡萄胚挽救的大致條件，為解決無核葡萄品種離體培養(yǎng)的培養(yǎng)條件及諸因子的適宜組合，提高幼胚離體發(fā)育和萌發(fā)成苗率提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種為適宜南方栽種的5個(gè)無核品種及其4個(gè)雜交組合：碧香無核、SP557、紅寶石無核、火焰無核、奧迪亞無核、火焰無核×寒香蜜、火焰無核×碧香無核、紅寶石無核×寒香蜜、紅寶石無核×碧香無核。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1

葡萄的雜交。

母本葡萄開花前2～3 d（花蕾頂端鼓起變圓，變?yōu)辄S綠色）開始去雄，輕輕摘掉花冠，注意不損傷柱頭，最后掐去穗尖，噴水保濕，套袋，掛牌。去雄后的第2天開始授粉，用毛筆蘸取少量花粉在已去雄柱頭上輕輕授粉，授好后迅速套袋，連授3 d。

1.2.2

形態(tài)學(xué)觀察。

從盛花后20 d開始至果實(shí)成熟，每7 d隨機(jī)取30粒漿果稱量其鮮重，剝離出種子，隨機(jī)取30粒稱重，并統(tǒng)計(jì)無核葡萄生長中的種子數(shù)，觀察種子和胚的外觀形態(tài)。

1.2.3

無核葡萄胚培養(yǎng)。供試材料在適宜取樣時(shí)間范圍內(nèi)摘取幼果，進(jìn)行消毒處理，流水沖洗30 min，然后于超凈工作臺用75%乙醇漂洗30 s，無菌水沖洗1次，再將果粒放入升汞溶液6 min，無菌水沖洗3～5次。將消毒后的果粒剖開取出胚珠，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)條件進(jìn)行接種（ER培養(yǎng)基），每瓶接種15粒，暗處理60～90 d后取胚，接種到WPM培養(yǎng)基，60 d后統(tǒng)計(jì)成苗率。培養(yǎng)室條件為：溫度25～30 ℃，相對濕度40%～60%，光照強(qiáng)度3 000 lx。

胚珠發(fā)育率為發(fā)育胚珠數(shù)占接種胚珠數(shù)的百分率；

胚萌發(fā)率為萌發(fā)胚數(shù)占接種的發(fā)育胚數(shù)的百分率；

成苗率為成活苗數(shù)占接種胚珠數(shù)的百分率。

1.2.4

胚挽救試管苗的移栽。

選擇繼代培養(yǎng)基上生長的壯苗，溫室（光強(qiáng)逐漸增強(qiáng)，有晝夜溫差）中鍛煉7～15 d；營養(yǎng)缽基質(zhì)煉苗，澆多菌靈液；長出新根和2～3片葉后移入苗圃地。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)測定結(jié)果

從表1可以看出，各品種的果實(shí)重量一直呈現(xiàn)明顯的增加趨勢，且品種不同，增長趨勢不同。各品種平均種子重的結(jié)果顯示，雖然部分品種呈現(xiàn)不規(guī)則的動(dòng)態(tài)變化，但整體趨勢大致相同，由于胚中途敗育，胚珠的質(zhì)量隨取樣時(shí)間的推移先呈增加趨勢，在一定時(shí)間后出現(xiàn)下降趨勢。對比種子重與種子數(shù)的變化趨勢，除奧迪亞無核外，各品種較為一致。奧迪亞無核的平均種子重不斷上升，而在第3次以后的測定中種子數(shù)目有所下降。總之，無核葡萄胚敗育對種子重量和數(shù)目都有不同程度的影響。

就種子形態(tài)來講，奧迪亞無核的種子大，而且成熟度一致；碧香無核和SP557的種子大小不整齊，成熟度也有較大差別；紅寶石無核和火焰無核的種子非常小，但成熟度比較一致。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)過程中，選擇ER培養(yǎng)基為無核葡萄品種的胚珠生長培養(yǎng)基，發(fā)育率高，說明ER培養(yǎng)基適合胚珠的生長，這與程琳琳等的報(bào)道[4-7]吻合。唐冬梅等的報(bào)

道也指出，Nitsch和ER培養(yǎng)基最適宜無核葡萄離體幼胚的發(fā)育[8]。而程和禾等通過對比NN69、B5、1/2MS培養(yǎng)基得出結(jié)論，NN69是奧迪亞無核葡萄的最佳胚挽救培養(yǎng)基[9]。無核葡萄適宜的培養(yǎng)基因品種而異，找到各品種最適宜培養(yǎng)環(huán)境還需進(jìn)一步的研究來完善。通過初步研究，大多數(shù)歐亞種無核葡萄最佳的接種時(shí)間在花后30～40 d，紅寶石無核雜交組合的取樣時(shí)間在40～50 d。這與唐冬梅等試驗(yàn)結(jié)果[8，10-11]一致。唐冬梅等試驗(yàn)表明，火焰無核最佳的取樣時(shí)間為盛花后40 d，奧迪亞無核為盛花后40 d[8]；蔣愛麗等對南方無核葡萄品種喜樂進(jìn)行了胚挽救，確定最適宜時(shí)間在盛花后30～40 d[10]。蘇家樂等通過對江南地區(qū)無核品種的系統(tǒng)研究，指出紅寶石無核最佳取樣時(shí)間在授粉后42 d[11]。程和禾等對于奧迪亞無核的研究則指出，花后49 d是奧迪亞無核葡萄幼胚搶救的最佳時(shí)期[9]。分析原因：①南北氣候的差異使得北方的成熟期稍晚于南方；②胚挽救條件的差別，包括培養(yǎng)基的種類、生長素的搭配等影響了胚珠及幼胚的生長速度。

胚挽救技術(shù)的應(yīng)用使無核葡萄作為母本進(jìn)行雜交育種成為可能，不僅大幅度增加了后代無核的幾率，也大大縮短了育種周期。所以在未來的育種工作中，胚挽救前景樂觀，依舊不可取代。而胚挽救過程中，接種時(shí)間、基本培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基相態(tài)、生長調(diào)節(jié)劑種類、碳源種類及濃度、pH、胚珠處理方式、培養(yǎng)環(huán)境等都會(huì)對胚挽救的萌發(fā)率和成苗率產(chǎn)生影響，且各因子相互作用，加大了對無核葡萄胚挽救技術(shù)體系構(gòu)建的難度。因此，從分子生物學(xué)和生理生化角度研究胚敗育的機(jī)理，拓寬品種范圍，探索各因子作用機(jī)制，擴(kuò)大影響因子數(shù)目，尋求適宜大多數(shù)無核葡萄胚挽救的基本程序，是以后很長一段時(shí)間的研究重點(diǎn)。

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