虎雪蘭與朱砂蘭、蕙蘭正反交育種及種子無菌萌發與增殖研究

李慧敏等

摘要 [目的]研究虎雪蘭與朱砂蘭、蕙蘭正反交育種及種子無菌萌發與增殖。[方法]以虎雪蘭、朱砂蘭、蕙蘭‘綠春蘭為親本，采用正反交雜交法進行育種試驗得到果實，對成熟的種子進行無菌萌發試驗，并對種子萌發獲得的小苗進行增殖研究。[結果]朱砂蘭為母本獲得雜交種子無菌萌發最適培養基為：1/2MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA+3%花寶1號+0.05%碳粉；最佳增殖及生長培養基為：1/2MS+1.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+3%花寶4號+0.05%碳粉。蕙蘭‘綠春蘭為母本獲得種子萌發最適培養基為：1/2MS+1.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L NAA+3%花寶1號+0.05%碳粉；最佳增殖及生長培養基為1/2MS+1.5 mg/L 6BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+3%花寶4號+0.05%碳粉。[結論]該方法為虎雪蘭的種質資源栽培提供了理論依據。

關鍵詞 虎雪蘭；種間雜交；無菌萌發；增殖；不親和性

中圖分類號 S682.31 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）13-03812-03

Abstract [Objective] This paper aims to study the aseptic budding and fast propagation on Cymbidium tracyanum var huanghua×Cymbidium mastersii interspecific hybridization seed. [Method] Cymbidium tracyanum var huanghua， Cymbidium mastersii and Cymbidium faberi Rolfe ‘Lv Chun Lan were employed as parents. The hybrid seeds were tested using direct crossing and reciprocal crossing， then germinated and compared with different medium in axenic culture. [Result] The results show that the best medium for the seeds of Cymbidium mastersii in axenic culture is 1/2MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA+3% Hyponex 1+0.05%C， the best medium for multiplication culture and differentiation is 1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+3% Hyponex 4+0.05%C. The medium for the seeds of Cymbidium faberi Rolfe ‘Lv Chun Lan in axenic culture is 1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+3% Hyponex 1+0.05%C， the best medium for multiplication culture and differentiation is 1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+3%Hyponex+0.05%C. [Conclusion] This method provides a theoretical basis for the germplasm resource cultivation of Cymbidium tracyanum var huanghua×Cymbidium mastersii.

Key words Cymbidium tracyanum var huanghua×Cymbidium mastersii； Interspecific hybridization； Aseptic germination； Propagation； Incompatibility

廣義的蘭花是指蘭科（Orchidaceae）植物，但中國人傳統上所稱的蘭花常常是指具有較高觀賞價值的蘭屬植物。隨著我國人民生活水平的不斷提高和消費觀念的逐步轉變，追求高雅健康的蘭文化已經成為一種時尚和潮流。只有新品種、高質量蘭花的推出才能進一步促進蘭花市場的發展。然而蘭花遠緣雜交育種因遺傳差異顯著而難度較高，雜交成功后的F1代變異性也較大。蘭花生長緩慢，育種周期較長，技術難點多，必須長期堅持才能取得成效。不少科技工作者對蘭花育種、種子萌發進行過研究[1-4]。蘭花種子萌發是雜交育種的一個技術難點，而在組織培養條件下的無菌萌發是主要的途徑之一。試驗利用人工雜交育種方式和組織培養技術，對虎雪蘭與朱砂蘭、蕙蘭雜交種子進行無菌萌發和生長分化研究，以期為探索蘭花人工雜交育種技術，培育具有一定特色的新品種，同時為蘭花種子無菌萌發及生長提供一定的理論參考，也為以后利用化學、物理誘變甚至基因工程創立新種質提供一定的技術方法和物質基礎；而且，對保護和利用優異蘭花種質資源，變資源優勢為經濟優勢和促進云南省蘭花走向世界都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。供試材料均由云南農業大學花卉研究所提供，為沉香虎頭蘭黃色素花與大雪蘭雜交的新品種“虎雪蘭”和朱砂蘭、蕙蘭“綠春蘭”。

1.2 方法

1.2.1 虎雪蘭與朱砂蘭、蕙蘭‘綠春蘭正反交。試驗地點為云南農業大學花卉研究所，于2011年11月在云南農業大學花卉所溫室內展開。挑選生長健壯、無病蟲害的親本植株，采用正反雜交方法。選擇在晴天，花朵開放2 d后的下午3：00進行授粉。授粉前先去除花粉塊頂端的藥帽，去除過程需謹防花粉塊掉落，把花粉塊用鑷子輕輕取下放入干燥的燒杯中備用；然后將父本的花粉塊置于母本的蕊腔中，再把母本上取下的花粉塊置于父本的蕊腔中。授粉完成后，清晰標注雜交組合名稱、雜交時間，授粉花朵數等。授粉之后對植株加強水肥管理并觀察果實發育情況并記錄結實率。

1.2.2 蒴果消毒。果實由深綠色轉變成淡黃綠色時，挑選尚未開裂的飽滿蒴果進行無菌播種試驗。首先對蘭花蒴果進行表面消毒，先采用10%～15%的次氯酸鈉水溶液浸泡10～15 min后用無菌水沖洗2～3次，再采用濃度0.1%升汞（HgCl2）浸泡5～10 min后，用無菌水沖洗4～5次。

1.2.3 無菌萌發誘導。培養基使用MS、1/2MS培養基，加入按實驗所需的不同濃度梯度和不同激素的配方以制作萌發誘導培養基。之后于無菌操作環境下，將蒴果橫置于徹底消毒過的培養皿內，按“+”方式切開消毒后的蒴果，用鑷子將其移動至培養基上方，使切口朝向培養基，并用鑷子輕輕敲打蒴果的外殼，將種子均勻分散并充分接觸于萌發誘導培養基表面以提高種子的成活率。最后將接種完成的培養基放在無菌培養室中進行光培養，環境溫度保持在24～26 ℃，最適光照2 000 lx。按時觀察試驗，記錄試驗數據和現象。篩選出最適合雜交種子萌發的培養基和激素條件。

1.2.4 無菌體系建立。將種子萌發后形成的原球莖轉移到不同激素濃度梯度配方下的繼代培養基上，記錄試驗數據和現象；篩選出最適合原球莖增殖的激素條件，建立快繁體系。培養條件與種子無菌萌發誘導相同。

2 結果與分析

2.1 正反交結果與分析 對3種蘭花雜交后生長和發育進行觀測，發現授粉4 d后，蕊柱的頂端開始膨大并開始下卷，分泌透明粘液，7～8 d后子房開始膨大，花瓣開始萎蔫，花朵開始收縮。一個星期后子房開始膨大。在試驗中發現，以虎雪蘭為母本的雜交組合，子房膨大14 d后開始變黃，爾后整個脫落。由表1可知，以朱砂蘭、蕙蘭‘綠春蘭為母本，均獲得雜交果實，結實率為20.0%和37.5%。結實率較低，而以虎雪蘭為母本與朱砂蘭、蕙蘭‘春綠蘭進行雜交均未獲得雜交果實。

3 討論

3.1 種間雜交不親和性 遠緣雜交是種質創新的有效途徑之一，但雜交的不親和性及雜種的不育性是遠緣雜交育種遇到的2大障礙[5]。另外種間雜交成功與否還與花粉管是否能夠順利到達胚囊，釋放精子，雌雄配子體能否順利結合以及受精后胚和胚乳是否能夠協調一致的生長等一系列因素有關。研究表明，雌雄配子體結合后胚與胚乳生長不協調，胚囊已經解體或者胚乳供給營養不足等原因也會使雌蕊脫落[6]。試驗中以虎雪蘭為母本的雜交組合，與果莢膨大至一定大小后出現果柄枯黃脫落現象，與張志勝等對墨蘭和大花蕙蘭種間雜交表現一致[4]，表現為受精后雜種不育障礙。以朱砂蘭、蕙蘭‘綠春蘭為母本結實率相對低，種子萌發過程中時間較長而且萌發率低。經過分析得出主要原因是由雜交親和力較弱引起：朱砂蘭、蕙蘭‘綠春蘭都屬于國蘭，與虎雪蘭親緣關系較遠。

3.2 種子無菌萌發方法可行性較高 蘭花種子非常細小、呈粉狀，沒有胚乳，胚內含有很少的營養物質，因此在自然條件下萌發率都很低。為了滿足藥用及花卉的需要，提高萌發率，各國學者在蘭科植物種子無菌萌發方面進行了大量研究。由于無菌播種克服了微生物的干擾，為種子萌發補充了必要的營養條件，使蘭花種子發芽率大大提高。試驗借鑒前人經驗以及已有技術對虎雪蘭雜交種子的萌發進行了研究，為雜交種子選出最佳組培配方，為今后建立蘭花繁育體系打下良好的基礎[1，4，7]。

3.3 培養基、激素配比需要與不同的蘭花材料以及生長時期相對應 基本培養基是植物組織培養的重要基質，由于每種植物的遺傳特性、生物學和生態學特性不同，所需的營養成分也不盡相同，對培養基的成分要求也存在差異[8-9]，要實現蘭花的快速繁殖，首先就必須對培養基進行篩選，在不同階段，選擇適當激素濃度。一般認為中低濃度無機鹽（1/2MS）比較適合蘭花種子的萌發[10]。在試驗中，雜交種子在培養基MS、1/2MS上培養下均能萌發，但是萌發率卻相差較大，在1/2MS培養基下萌發率較高、萌發時間相對較短，說明低鹽培養基較適合試驗雜交種子的萌發，支持了此結論。

3.4 添加物和褐化問題的相關性 在培養基中添加適量的天然提取物有利于蘭花種子的萌發和生長，研究在培養基中添加了8%的香蕉泥，但加入香蕉泥之后，由于添加物內部激素的影響，促使植株活力降低，吸收能力減弱，導致葉色偏黃，苗體較弱，起不到很好的復壯作用，因此并不是所有的蘭花都適合此法。試驗加入香蕉泥之后出現輕微褐化現象，轉而考慮使用一類具有吸附功能的添加劑活性炭。據報道，0.1%～0.5%活性炭對吸附酚類氧化物的效果很明顯[11]。試驗中加入了0.05%碳粉，可以有效抑制褐化現象的出現。

試驗以朱砂蘭、蕙蘭‘綠春蘭為母本，虎雪蘭為父本，成功得到果實。對成熟的種子進行無菌萌發試驗，并對種子萌發獲得的小苗進行增殖研究。結果表明，低鹽的1/2MS培養基，利用花寶和碳粉，加入適當濃度的BA、NAA和KT對蘭花種子萌發及種子萌發后得到的蘭花組培苗增殖有促進作用。

參考文獻

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