一株北高叢藍莓內生真菌的液體發酵條件優化及生長動力學分析

李學龍 楊鎮 王娜 龔娜 馬曉穎 楊濤

(遼寧省農業科學院微生物工程中心，遼寧沈陽 110161）お

摘要

［目的］優化北高叢藍莓內生真菌的液體發酵條件。［方法］以一株分離自北高叢藍莓的內生真菌菌絲提取物為研究對象，對液體培養條件進行優化。選擇一種適合工業化生產的培養基：玉米粉90 g/L，豆粕5 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4 0.6 g/L，維生素B1 10 ﹎g/L，以菌絲體得率為指標，通過正交試驗考察培養溫度、培養基pH、搖床轉速、接種量，以確定最適培養條件。［結果］在培養溫度25 ℃，搖床轉速160 r/min，pH值7.0，接種量5%時，菌絲體生長量達到最大。［結論］初步得到該菌的生長動力學參數，為工業化生產提供一定依據。

關鍵詞 發酵；內生真菌；培養條件；動力學分析

中圖分類號 SB188文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2014）19-06157-02

お

The Growth Kinetics Analysis and Fermentation Conditions Optimization of a Strain of North High Plexus Endophytic Fungus from Blueberry

LI Xue瞝ong, YANG Tao et al

(Microbial Engineering Center, Liaoning Academy of Agricultural Sciences, Shenyang, Liaoning 110161)

Abstract ［Objective］ To optimize the liquid fermentation conditions of a strain of north high plexus endophytic fungus from blueberry. ［Method］ A medium suitable for industrial production was selected: corn flour 90 g/L, soybean meal 5 g/L, KH2PO4 1 g/L, MgSO4 0.6 ゞ/L, vitamin B1 10 mg/L. With mycelium yield as index, the culture medium temperature, pH, shaking speed, inoculum was investigated through orthogonal test in order to determine the optimum culture conditions. ［Result］ The results showed that the cultivation temperature 25 ℃, shaking speed 160 r/min, pH 7.0, inoculum 5%, mycelium growth reaches the maximum. ［Conclusion］ The microbial growth kinetics parameters were obtained, which will provide a basis for industrial production.

Key wordsFermentation; Endophytic fungi; Culture conditions; Dynamic analysis

お

基金項目 遼寧省自然科學基金項目（No.201102100）。

作者簡介

李學龍（1984-），男，黑龍江牡丹江人，助理研究員，碩士，從事植物內生菌發酵工藝研究。*通訊作者，研究員，博士，從事農業微生物資源研究。

收稿日期 20140528

植物內生菌能產生促進植物生長物質，如植物生長素、赤霉素、細胞激動素等，能直接促進植物生長。從蘭科藥用植物中分離的5種內生真菌能產生赤霉素、吲哚乙酸、脫落酸、玉米素、玉米核苷等植物激素，對蘭花的生長發育有較好的促進作用［1-2］。研究表明，內生菌可通過自身的代謝產物或借助于信號傳導作用對植物體施加影響［3］。植物內生真菌的液體培養具有生產周期短、產量高、質量易于控制等優勢，有利于規模化生產［4-6］。目前對北高叢藍莓內生真菌的液體培養及代謝產物研究較少，筆者選擇一種適合工業發酵的培養基，并通過液體培養條件的優化及生長動力學分析，以期為大規模工業化生產提供技術依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1

供試菌株。由遼寧省農業科學院微生物工程中心實驗室從北高叢藍莓根內分離，編號為LM003。

1.1.2

主要儀器。pH電極和溶氧電極，均購自梅特勒-托利多儀器有限公司；發酵罐，購自上海保興生物設備工程有限公司；搖床，購自哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；培養箱，購自施都凱儀器設備（上海）有限公司。

1.1.3

主要試劑。所用試劑均為國產分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1

培養基的制備。①斜面及平板培養基。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 ml，121 ℃滅菌25 min。②種子培養基。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，麥芽粉5 g，維生素B1 0.5 mg，蒸餾水1 000 ml，121 ℃滅菌25 min。③發酵培養基。玉米粉90 g，豆粕5 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4 0.6 g，維生素B1 10 mg，蒸餾水1 000 ml，121 ℃滅菌25 min。

1.2.2

菌種活化。將編號LM003的菌種從試管斜面上接到平板培養基上，恒溫25 ℃培養7 d。

1.2.3

一級種子培養。將活化好的真菌用打孔器瓊脂挖塊接種于裝有200 ml種子培養基的三角瓶，于25 ℃，160 r/min搖床上振蕩培養3 d作為種子。

1.2.4

液體發酵有關參數的考察。通過4因素3水平正交設計試驗（表1）考察培養溫度、培養基pH、搖床轉速、接種量等條件對菌絲體生長的影響，篩選最佳發酵條件。

お

表1 培養條件正交試驗設計

水平 A溫度∥℃ B pH C轉速∥r/min D接種量∥%

1 20 6 120 5

2 25 7 140 10

3 30 8 160 15

1.2.5

液體深層發酵的生長動力學考察。將確定的發酵培養基裝于10 L發酵罐中，裝量為6 L，121 ℃滅菌20 min，冷卻后接種一級種子，接種量為5%，溫度25 ℃，初始pH 7.0，攪拌轉速160 r/min，培養7 d，每天取樣。將收獲的發酵液過濾，菌絲體用蒸餾水洗滌，80 ℃烘干3 h后測干重，發酵液直接用于pH和殘糖的測定，制得生長代謝曲線。

2 結果與分析

2.1 一級種子液培養情況

搖床培養前2 d，接入的菌絲塊呈球狀不斷增大，發酵液較澄清，第3~5天出現大量微小菌絲球，并不斷增長，發酵液較粘稠，培養至第5天接入搖瓶進行培養參數的考察。

2.2 液體培養有關參數的確定

液體培養中，培養基初始體積的不同，對菌絲體干濕重之比影響較大，因此實驗中采用菌絲體干重來衡量菌絲體生長情況，以g/L記。以下試驗以液體發酵培養基進行發酵培養。

由表2可知，對菌絲體生長的影響因素由大到小的順序是培養基pH值＞培養溫度＞搖床轉速＞接種量。菌體最適培養條件為A2B2C3D1該培養條件下，菌絲體干重為20.5 ゞ/L。對試驗結果進行方差分析可知，pH值對液體菌種的培養有顯著影響（玃<0.05）。pH值除了對菌體本身的影響外，還影響培養基中的有機化合物的離子化和營養物質的溶解度，從而影響菌體對基質的利用速度。

表2 液體培養條件的正交設計結果

因素 A B C D 菌絲體干重∥g/L

1 1 1 1 1 17.3

2 1 2 2 2 18.0

3 1 3 3 3 12.5

4 2 1 2 3 19.7

5 2 2 3 1 20.5

6 2 3 1 2 13.2

7 3 1 3 2 19.5

8 3 2 1 3 19.1

9 3 3 2 1 11.0

玐1 15.93 18.83 16.53 16.27

X2 17.80 19.20 16.23 16.90

X3 16.53 12.23 17.50 17.10

R 1.87 6.97 1.27 0.83

2.3 生長動力學考察結果

2.3.1

生長量變化曲線。 圖1表明，菌絲體在0~1 d生長緩慢，為生長適應期，第2天起可見絮狀菌絲逐漸增多。在第2~3天為對數生長期，菌絲體急劇增加，菌絲相互纏繞形成菌絲球。第4~5天為穩定生長期，體內次生代謝產物積累較多，第6~7天菌絲體生物量減少，發酵液變粘稠，開始自溶。因此確定菌絲體較適合的收獲時間為第4~5天。

圖1菌絲體液體深層培養時間對菌絲生長量的影響

2.3.2

糖代謝曲線。圖2表明，菌絲體的生長過程在第1~3天對糖的利用比較迅速，最初糖濃度為19.0 g/L，培養7 d時剩余的還原糖濃度為9.7 g/L，生長過程中平均消耗速率為1.3 g/L·d，在對數生長期內還原糖吸收利用較快，濃度從17.1 g/L降到12.4 g/L，均消耗速率為2.35 g/L·d，第4~6天對糖的利用趨于緩慢。糖代謝曲線的趨勢與菌絲體生長量的變化的趨勢基本相符。

圖2糖代謝曲線

2.3.3

pH值變化曲線。圖3表明，菌絲體的液體培養過程中，pH值在7.0~5.15范圍內波動，基本保持穩定。培養的第2~3天pH下降較快，第4~7天變化較小，第7天pH小幅上升，可能與菌絲體自溶有關。培養結束時發酵液pH值為5.19。

圖3pH值變化曲線

2.3.4

溶氧DO變化曲線。圖4表明，在菌體的生長過程中，溶氧值在21%~100%范圍內波動。菌體發酵0~1 d的溶氧變化較小，經過24 h后，溶氧開始明顯下降，菌體代謝旺盛，表現為對數生長階段。發酵至4~6 d時，溶氧下降緩慢，菌體進入平衡生長期。發酵至6~7 d時發酵液溶氧值基本無變化，菌體生長基本保持停止狀態，發酵結束。

圖4 溶氧值變化曲線

3 結論與討論

液體深層培養條件不僅影響菌絲體的生長速度和形態，而且對代謝產物的生成及后續提取也有很大影響，所以選擇合適的培養條件對獲得大量菌絲體和代謝產物具有重要

意義［7］。正交試驗表明，菌絲體最適培養條件為培養溫度

25 ℃，搖床轉速160 r/min，接種量5%，培養基pH 7.0,該培養條件下，菌絲體干重為20.5 g/L。該培養基價格低廉，來源廣泛，適合工業化生產使用。

生長動力學分析顯示，菌絲體的生長基本呈“S”型曲線，第4~5天為穩定生長期，菌體內次生代謝產物積累較多，是收獲菌體的最佳時間。大規模工業發酵是一個復雜的過程，發酵的逐級放大階段不是培養體積的簡單放大，需要調節溫度、pH、溶解氧、細胞生長及產物形成等發酵參數，以提高發酵效率。因此要進一步研究上述發酵參數的變化情況，為大規模發酵培養提供技術支持。

參考文獻

［1］ ADHIKARI T B，JOSPH C M.Evaluation of bacteria isolated from rice for plant growth promotion and biological control of seeding disease of rice［J］.Can J Microbiol,2001,47:916-924.

［2］ 李玉珍.植物激素的研究進展［J］.河南科技學院學報:自然科學版,2007,35（4）:50-53.

［3］ 余朝閣,李天來，杜妍妍，等.植物誘導抗病原性及其信號轉導途徑［J］.北方園藝,2007(7):73-76.

［4］ 汪宇,于榮敏，佟志清，等.蛹蟲草液體培養條件的優化及生長動力學考察［J］.中國野生植物資源,2003（8）:5-6.

［5］ 李亞東，郝瑞，陳偉，等.越桔對長白山區酸性土壤的適應性［J］.園藝學報，1994，21(2):129-133.

［6］ 弓明欽，陳應龍，仲崇祿.菌根研究及應用［M］.北京:中國林業出版社，1997：51-60.

［7］ 司美茹，薛泉宏，來航線.放線菌分離培養基篩選及雜菌抑制方法研究［J］.微生物學通報，2004，31(2):61-65.