過量表達miR319對番茄果實品質的影響

昌偉 李子龍 胡燦麗 范敬偉 王建立 楊瑞

(1.北京農學院植物科學技術學院，北京 102206；2.北京農學院農業應用新技術北京市重點實驗室，北京 102206)お

摘要

［目的］探索過量表達miR319和過量表達LA對番茄果實品質的影響。［方法］以番茄野生型M82、過量表達miR319和過量表達LA番茄為材料，分析過量表達miR319和過量表達LA對番茄果實品質的影響。［結果］過量表達miR319植株的可滴定酸、可溶性糖、V瑿和番茄紅素的含量下降，而過量表達LA植株的可滴定酸、可溶性糖、番茄紅素的含量上升，V瑿含量下降。2個轉基因植株可溶性蛋白的含量與M82比較都有所上升。［結論］過量表達miR319和過量表達LA對番茄果實品質的影響是相反的，過量表達LA可以提高番茄果實品質。

關鍵詞 番茄（玈olanumlycopersicum）；miR319；番茄品質

中圖分類號 SB188文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2014）19-06150-02

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Effect of Over睧xpression miR319 on Fruit Quality of Tomato

CHANG Wei, YANG Rui et al

(College of Plant Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206)

Abstract ［Objective］ The present study aimed to explore the effects of over瞖xpression miR319 and over瞖xpression LA on fruit quality of tomato. ［Method］ Effects of over瞖xpression miR319 and over瞖xpression LA on fruit quality of tomato were analyzed by using tomato wild type M82, over瞖xpression miR319 and over瞖xpression LA as material. ［Result］ The results showed that: The over瞖xpression jaw睤 titratable acid, soluble sugar content V瑿 and Lycopene content were decreased, but over瞖xpression LA, plant titratable, soluble sugar content and Lycopene content were increased, and V瑿 content was decreased. And two transgenic plants soluble protein content were better than M82. ［Conclusion］ The effects of over瞖xpression of miR319 and over瞖xpression LA on fruit quality of tomato are opposite and overexpression LA can improve fruit quality .

Key words Tomato; MiR319; Tomato nutritional quality

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基金項目 長城學者（CIT·&·TCD20130323）。

作者簡介

昌偉（1989-），男，安徽滁州人，碩士研究生，研究方向：蔬菜生理與優質安全栽培。*通訊作者，實驗師，從事蔬菜生理與優質安全研究。

收稿日期 20140531

番茄（玈olanumlycopersicum）是蔬菜中營養價值較高的品種之一，也是近年來我國設施栽培面積較大的作物。番茄果實的發育是通過一系列生物和非生物因素相互調控的。茉莉酸作為植物調節劑，可以在番茄的整個生長過程起到非常重要的作用。魏佳等［1］發現利用茉莉酸突變體玸pr2發現茉莉酸能夠促進果實發育時期還原糖的積累。張佳楠等［2］利用Micro-Tom為試驗材料，外源噴施茉莉酸甲酯，發現番茄果實中果糖和葡萄糖含量在整個生長發育期都呈遞增趨勢。Schommer等［3］研究發現，miR319的靶基因TCP轉錄因子家族成員調控茉莉酸生物合成進程中關鍵酶基因LOX2從而控制著茉莉酸的生物合成。筆者以M82為背景的過量表達miR319和過量表達LA為材料，比較3個品種番茄果實的品質差異，探索miR319對番茄果實的影響，以期為番茄的進一步開發利用提供依據。

1材料與方法

1.1 材料

試驗于2013年10月~3月在北京金六環農業園進行。試驗材料為番茄野生種M82，以M82為背景的過量表達miR319和過量表達LA的轉基因番茄。取新鮮果實，研磨成原漿，按照不同試驗要求精確稱量勻漿，然后進行各項品質指標的測定。

1.2 可溶性蛋白的測定

用考馬斯亮藍G-250法測定［4］。準確稱取4.000 g番茄果實勻漿，加入10 ml蒸餾水混勻，于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液即為可溶性蛋白溶液。吸取1.0 ml上清液，加入5.0 ml考馬斯亮藍G-250溶液，充分混合，放置2 min后在波長595 nm出比色。重復3次。

1.3 可溶性糖的測定

采用硫酸蒽酮比色法［4］，準確稱取0.500 g番茄果實勻漿，加入到15 ml蒸餾水中，沸水煮沸20 min，冷卻后定容至25 ml。離心10 min（5 000 r/min），上清液為待測液，在620 nm下測得吸光度。重復3次。

1.4 有機酸總量的測定

采用標準堿滴定定量法。取10.0 g勻漿，約用50 ml已煮沸、冷卻的蒸餾水定容 250 ml。充分振蕩后過濾。吸取20 ml濾液，加入酚酞，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定。重復3次。

1.5 維生素C的測定

采用2,6-二氯酚靛酚法測定［4］。準確稱取5.000 g番茄果實勻漿，加入10 ml濃度2%草酸，轉移到50 ml容量瓶中定容。用高嶺土和溶液混合，過濾。取10 ml濾液，用已標定的2,6-二氯酚靛酚溶液滴定。重復3次。

1.6 番茄紅素的測定

用GB/T 14215-2008番茄醬罐頭標準中測量番茄紅素的方法測量［5］。準確稱取0.200 g番茄果實勻漿，置于10 ml燒杯中，加入少量無水甲醇，過濾，反復至無色，保留殘渣。分次用少量甲苯浸提番茄紅素，過濾，至濾液無色，濾液定容至50 ml。在485 nm下測定提取液的吸光度。重復3次。

1.7 統計分析

數據應用Excel2007、spss19.0和origin8分別進行數據統計、差異顯著性分析和作圖分析。

2 結果與分析

2.1 轉基因植株對番茄果實可溶性糖的影響

圖1表明，M82、過量表達miR319植株、過量表達LA植株的含糖量分別是5.69%、4.52%和7.49%。過量表達miR319之后番茄果實的含糖量下降，而過量表達miR319靶基因LA之后，番茄果實的含糖量上升。這可能是在番茄果實成熟時，糖含量受到miR319的調控，從而使番茄果實的含糖量下降。結果表明，在番茄果實成熟時，過量表達miR319植株的番茄果實含糖量下降，而過量表達LA植株的番茄果實含糖量上升。miR319可能單獨或者聯合其他機制調控果實糖積累時的過程，是果實內的糖含量發生變化。

注：不同大寫字母表示差異極顯著，不同小寫字母表示差異顯著，相同字母表示差異不顯著，下同。

圖1 不同番茄果實含糖量

2.2 轉基因植株對番茄果實可滴定酸的影響

圖2表明，M82果實的可滴定酸含量為0.61%，過量表達miR319植株的果實可滴定酸含量為0.48%，下降0.13%，下降達到極顯著（㏄<0.01）。過量表達LA果實的可滴定酸含量增加0.1%，增加達到極顯著（玃<0.01）。這可能在番茄果實成熟的過程中，可滴定酸含量受到miR319的負調控，從而使番茄果實內的可滴定酸含量下降；而過量表達miR319靶基因LA時，抑制了miR319的表達，使番茄果實內的可滴定酸含量┥仙。

圖2 不同番茄果實可滴定酸含量

2.3 轉基因植株對番茄果實可溶性蛋白的影響

圖3表明，M82、過量表達miR319植株、過量表達LA植株的蛋白質含量為分別是122.1、138.5和134.4 μg/g。過量表達miR319和過量表達LA植株番茄果實的可溶性蛋白相對于M82來說分別上升16.4和13.3 μg/g，上升都達到了顯著性（玃<0.05）。有可能是在番茄果實成熟的過程中，過量表達miR319和過量表達LA植株體內的誘導番茄果實中其他蛋白質的表達，使果實內的可溶性蛋白含量上升。

圖3 不同番茄可溶性蛋白含量

2.4 轉基因植株對番茄果實維生素C的影響

圖4表明，M82、過量表達miR319和過量表達LA的維生素C的含量分別是1 762.7、1 440.7和1 593.2 mg/kg。結果表明，在番茄果實成熟時，過量表達miR319植株的番茄果實和過量表達LA植株的番茄果實的維生素C含量都有所下降。與野生番茄M82相比較都有極顯著差異（玃<0.01）。在番茄果實成熟的時候，過表達miR319和過表達LA的維生素C含量下降。

圖4 不同番茄維生素C含量

2.5 轉基因植株對番茄果實番茄紅素的影響

圖5表明，M82、過量表達miR319和過量表達LA的番茄紅素含量分別為89.0、84.0和98.0 mg/kg FW。與M82相比，過量表達miR319植株的番茄果實番茄紅素下降5.0 mg/kg FW，而過量表達LA植株的番茄果實番茄紅素上升9.0 mg/kg FW，效果顯著（玃<0.05）。汪俏梅等［6］研究發現，內源茉莉酸能通過郵箱番茄紅素合成相關基因而正調控番茄紅素的合成，MeJA處理可以提高番茄紅素的合成。試驗結果表明，在過量表達miR319植株中，miR319負調控茉莉酸合成通路中Lox2基因，使番茄內的茉莉酸含量下降，從而使果實內的番茄紅素下降。而在過量表達LA植株中，正向調控茉莉酸表達，使番茄中茉莉酸含量上升，使番茄果實內的番茄紅素含量上升。

圖5 不同番茄紅素含量

3結論與討論

番茄作為模式植物，在番茄的轉基因上科學家們做了大量的試驗，主要包括一些抗病蟲害、提高產量、延遲成熟等品種。1994年，Calgene公司第1次將多聚半乳糖醛酸酶的反

義cDNA轉入番茄的基因組中，首先研制出了延遲成熟的轉基因番茄Flavr-SavrTMP中，并被批準用于商業化種植，這給研制轉基因番茄提供了可行性。但是現在轉基因食品在國內沒有得到大范圍的推廣。試驗結果發現，在過量表達miR319植株番茄果實中可溶性糖和可溶性蛋白都有所下降，說明在番茄果實成熟期，過量表達miR319植株體內中miR319表達量的提高，導致植株體內茉莉酸含量下降，使可溶性糖和可溶性蛋白的含量下降，而在過量表達miR319靶基因LA植株中，使茉莉酸含量上升，可溶性糖和可溶性蛋白的含量上升，這與前人的研究一致［1］。激素對植物體的整個生長發育的調節機制是非常復雜的，通常果實發育并不是由單一激素來調控的，大多是多個激素共同調控的結果。所以下一步的工作可以通過對多個激素共同的作用來研究對番茄果實的影響。

利用轉基因植株來研究果實的生長機制和提高番茄產量是農業科學非常重要的手段。從試驗結果到生產實踐是需要非常長的時間和機制。試驗僅僅是從果實品質來評價轉基因番茄，如果后期要大面積推廣，應該嚴格按照國家關于轉基因作物的相關標準進行評價，并且在種植過程中為防止轉基因番茄破壞生態平衡，應該在相對封閉的環境中種植和管理，要嚴格與傳統的農作物分開，規范轉基因番茄的生產和加工過程。

參考文獻

［1］ 魏佳，賈承國，李振，等.利用突變體研究植物激素對番茄果實品質的影響［J］.核農學報，2009，23(3):521-525.

［2］ 張佳楠,崔娜,王楠,等.外源茉莉酸甲酯對不同發育時期番茄果實糖含量的影響［C］//中國園藝學會.中國園藝學會2013年學術年會論文摘要集.中國園藝學會,2013:1.

［3］ SCHOMMER C，PALATNIK J F，AGGARWAL P，et al.Control of jasmonate biosynthesis and senescence by miR319 targets［J］.PLoS Biology，2008，6(9):230.

［4］ 曹建康，姜微波，趙玉梅.果樹采后生理生化實驗指導［M］.北京：中國輕工業出版社，2007.

［5］ 尚德軍，王軍.番茄紅素測量方法的改進［J］.現代科學儀器，2006（1）:117-118.

［6］ 汪俏梅，張敏，陳德龍.果實中類胡蘿卜素的激素調控［J/OL］.http://www.docin.com/p-561020321.html.