響應面法優化綠色木霉H06產孢發酵培養基

梁昌聰 劉磊 張建華 郭立佳 王偉偉 黃俊生

摘 要 采用響應面法對綠色木霉H06菌株產孢發酵培養基進行了優化。首先利用Plackett-Burman實驗設計篩選出影響產孢的 3個主要因素： 玉米粉、大豆粕和 KH2PO4。在此基礎上運用最陡爬坡路徑法逼近最大響應值區域，最后利用響應面分析法確定主要因子之間的交互作用及最佳條件。結果表明，蔗糖10 g/L、玉米粉12.75 g/L、NH4NO3 2 g/L、大豆粕4.65 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO4 3.32 g/L、H06最大理論孢子含量為3.29×109個/mL。經3次平行實驗驗證，實際平均孢子含量與預測孢子含量相近，比之前的孢子含量提高了197%。

關鍵詞 響應面法；綠色木霉；產孢；優化

中圖分類號 S216.2 文獻標識碼 A

香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌引起的一種毀滅性的土傳病害，已嚴重危害到香蕉的生產及香蕉產業[1]。目前綜合防控技術是香蕉枯萎病防治的主要手段，木霉（Trichoderma spp.）作為一種重要的植病生防菌一直受到普遍關注。綠色木霉菌（Trichoderma viride）廣泛地分布于自然界，可在多種營養基質上快速生長， 對多種植物病原菌有重寄生作用，能有效地競爭營養和生存空間，還可以產生抗生素和攻擊多種病原所需要的酶，所以被認為是一種很有開發潛力的生防菌[2]。

綠色木霉菌H06（T. viride）是中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所微生物資源研究與利用課題組從香蕉根際土壤中分離獲得的拮抗鐮刀菌的菌株，對香蕉枯萎病等植物病害有明顯的防治效果[3]，應用前景廣闊。

響應面分析法（Response Surface Methodology，RSM），包括試驗設計、建立模型、分析模型合理性和尋求最優解等眾多試驗與統計技術。響應面分析法是降低開發成本、優化實驗條件、提高生產效率、解決生產實際問題的更為有效的方法[4-7]。 該法在生物發酵方面已有廣泛應用[7-9]。目前國內關于綠色木霉產孢優化的研究方法比較單一，主要為單因素法和正交法。如肖龍龍等[10]用單因素法確定了綠色木霉產孢的最優條件，劉時輪等[11]用單因素法和正交法確定了綠色木霉菌株Tv04-2固體最優發酵條件。但是對綠色木霉液體產孢研究很少并且將響應面分析法應用到綠色木霉液體產孢發酵培養基優化目前未有報道。

因此，本實驗采用Minitab16軟件中的Plackett-Burman設計法[12]、最陡爬坡路徑法[13]和響應面分析法（RSM）中的Box-Behnken設計[14]相結合對綠色木霉產孢進行搖瓶發酵培養基的優化，提高發酵液中孢子含量， 為綠色木霉發酵提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 綠色木霉菌H06，從香蕉根際土壤中分離獲得，由本實驗室保藏。

1.1.2 培養基 斜面培養基：PDA培養基。種子培養基：蔗糖20 g、NH4NO3 4 g、MgSO4·7H2O 1 g、KH2PO4 2 g、水1 000 mL。

初始發酵培養基：蔗糖10 g、玉米粉10 g、NH4NO3 2 g、大豆粕5 g、MgSO4·7H2O 1 g、KH2PO4 2 g、水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法 （1）種子液制備：取 28 ℃ 下培養成熟的斜面試管1支，用無菌生理鹽水沖洗，適當稀釋，配制成108個/mL 的孢子懸浮液，以 10%的接種量接入裝有100 mL 種子液的 250 mL三角瓶中，28 ℃ 、180 r /min 下培養 48 h。

（2）搖瓶培養條件：初始發酵培養基 250 mL 搖瓶裝液量 100 mL，以 5%的接種量接種，28 ℃、180 r/min下培養 72 h。

（3）孢子含量測定：用血球計數板法測定。

1.2.2 實驗設計 （1）Plackett-Burman設計法篩選影響發酵液孢子含量的顯著性影響因素：Plackett-Burman設計法是一種近飽和的2水平實驗設計方法。它基于非完全平衡塊原理，能用最少實驗次數估計出因素的主效應，從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素以供進一步研究[15]。將初始發酵培養基中的6個組分作為影響因素進行全面考察，選擇9因子及實驗次數N=12的實驗設計，以C、E、I作為空項以估計實驗誤差，以A、B、D、E、G、H分別代表蔗糖，玉米粉，NH4NO3，大豆粕，MgSO4·7H2O，KH2PO4，每個因素取高低2個水平（表1）。

（2）最陡爬坡路徑方法確定重要因子的最適濃度范圍：響應面只有在臨近最佳值時才能建立有效的響應面方程。最陡爬坡法以實驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據各因素效應值的大小確定變化步長，能快速、經濟地逼近最佳值區域[16]。根據（1）Plackett-Burman設計法實驗的結果，做最陡爬坡實驗。

（3）響應面分析法確定最佳培養基配方：以爬坡設計得出的實驗結果為依據進行Box-Behnken設計，用軟件 Minitab16對實驗進行回歸分析并且進行誤差分析并求得最優值，得出響應面分析結果，進而確定最佳培養條件，最后依據回歸方程繪制響應面分析圖。

（4）驗證實驗：用所得到的最佳培養條件進行3次平行實驗，取平均值，以驗證模型是否可靠，進而得出最終優化結果。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman實驗設計結果分析

Plackett-Burman實驗設計見表2，分析結果見表3。表3的P值大小可以看出，對綠色木霉H06初始培養基中的孢子含量具有顯著影響的因子依次是H>E>B，即KH2PO4>大豆粕>玉米粉，確定這3個因素作為下一步實驗的關鍵因素。

2.2 最陡爬坡實驗

根據表 3 中 B、E、H 3 個因素估計系數的正負效應，依次增大或減小，KH2PO4、玉米粉是正效應，應依次增大；大豆粕是負效應，應依次減小。爬坡實驗結果見表4。結果表明，隨著玉米粉、KH2PO4濃度逐漸增大，大豆粕濃度逐漸減小，H06孢子含量呈現先增大后減小的變化。當玉米粉為13 g/L，大豆粕為 4.5 g/L，KH2PO4為3.5 g/L 時，孢子含量達到最大，為3因子的最大響應值區域。因此以表4中實驗號4各因素水平為中心值設計后續響應面實驗。

2.3 響應面設計結果與分析

3個重要因子的最適合濃度范圍確定后，以玉米粉13 g/L，大豆粕4.5 g/L，KH2PO4 3.5 g/L為中心點實施響應面分析，各自變量水平見表5， Box-Behnken設計及結果分析見表6和表7。該二次模型多元相關性系數R2=0.965 5，表明僅有 3.45%的變異不能由此模型解釋； 回歸模型p值（ prob>F）=0.004 表明模型是顯著的，失擬項p值為0.264，表明失擬不顯著，模型沒有失擬現象。模型的線性、平方的影響是顯著的，交互作用影響不顯著。經回歸擬合后，得到二次多項式方程：

Y=-60.723 7+8.265 42X1+3.04X2+2.505 83X3-0.309 58X1X1-0.328 333X2X2-0.218 333X3X3-0.01X1X2-0.095X1X3+0.04X2X3

根據上述擬合回歸方程做出響應面分析圖，見圖1～圖3。圖1中當固定KH2PO4 3.32 g/ L時，玉米粉從 12 g/L 增大至 14 g/L，大豆粕從 4 g/L 增大至5 g/L 的過程中，發酵液孢子含量均呈現先增大后減小的趨勢，曲面的頂點即為孢子含量最大值點。同理，圖2和圖3中的曲面分別反映了玉米粉和KH2PO4、大豆粕和KH2PO4的交互作用。

2.4 模型驗證

由模型可得玉米粉12.75 g/L，大豆粕為4.65 g/L，KH2PO4為3.32 g/L時，預測的最大響應值為3.29×109個/mL。為證實預測結果， 在該濃度下進行重復搖瓶實驗，實驗重復3次，結果分別為3.26×109、3.33×109、 3.24×109個/mL，平均值為（3.28±0.05）×109個/mL與預測值3.29×109個/mL接近，二者的良好擬合性證實了模型的有效性。優化后得到綠色木霉菌H06菌株的發酵培養基配方為：蔗糖10 g/L、玉米粉12.75 g/L、NH4NO3 2 g/L、大豆粕4.65 g/L、MgSO4 1 g/L、KH2PO4 3.32 g/L。

3 討論與結論

發酵培養基優化的常用方法有單因素法和正交法。單因素法只針對某一因素的影響，不考慮發酵培養基多種組分間的交互作用，難以取得發酵培養基優化的最佳結果[17]。正交法只能得到最佳因素水平的組合，同時也考慮發酵培養基的多種因素間的交互作用；但在正交法中，當考慮因素之間的交互作用時，正交試驗次數會大大增加，另外正交法在最后選取最佳實驗方案時，對于不顯著因素的選取一般是憑經驗[17]。響應面分析法是 1951年Box- Wilson開發的用于化學過程因子優化的一種綜合性方法，用于研究多因子系統中因子交互作用達到最大響應值時所對應的最佳條件[17]。國內外不少學者通過響應面分析法在發酵培養基優化方面取得了良好效果[10-12， 15-16]。

本研究通過Plackett-Burman設計，快速有效地從6個影響綠色木霉菌產孢子的因素中篩選出3個顯著性影響因素： 玉米粉、大豆粕和KH2PO4，然后利用最陡爬坡法逼近最大響應值區域并用 Box-Behnken設計得出最佳培養基組合： 蔗糖10 g/L、玉米粉12.75 g/L、NH4NO3 2 g/L、大豆粕4.65 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO4 3.32 g/L。在最佳培養基組合下，綠色木霉菌H06實際孢子含量達到3.28×109個/mL，與理論最大孢子含量3.29×109個/mL接近，說明運用響應面法優化綠色木霉菌H06液體發酵孢子含量是合理可靠的。經優化，孢子含量比優化前提高了197%。

由于目前綠色木霉菌常用于發酵制備各種酶[18-20]， 國內對該菌的固體產孢發酵研究較多[10-11]，而關于該菌的液體產孢特性的研究較少[21]， 因此本研究的結果對于綠色木霉菌在發酵上有重要意義。

對于綠色木霉菌H06的發酵條件如溫度、pH、接菌量等是下一步的工作，在發酵培養基與發酵條件確定后，進行100、1 000 L等發酵罐的逐級放大，以優化確定綠色木霉菌的液體發酵生產工藝。

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