香蕉MuMADS1與泛素激活酶（MuUBA）在采后果實中的相互作用

張妮 劉菊華 賈彩紅 張建斌 徐碧玉 金志強

摘 要 以香蕉MuMADS1為誘餌載體，采后2 d的香蕉果實的cDNA文庫為獵物，采用酵母雙雜交的方法得到了泛素激活酶E1的基因片段，命名為MuUBA。采用雙分子熒光互補技術進一步驗證MuMADS1與MuUBA在植物體內的相互作用。熒光實時定量PCR結果表明，MuMADS1和MuUBA在香蕉中子房發育第4個階段的表達量最高，但是在莖中的表達量很低，表明其在不同的組織和發育的果實中的表達具有協同性。MuMADS1和MuUBA的表達都受外源乙烯和1-MCP的高度調控，推測MuMADS1和MuUBA在香蕉果實的采后成熟過程中具有很重要的作用。

關鍵詞 香蕉；酵母雙雜交；MuMADS1；MuUBA；相互作用；采后果實

中圖分類號 Q789 文獻標識碼 A

MADS-box基因編碼的蛋白質是一類數量龐大的具有一定保守性的轉錄因子，主要在植物中被發現，但是在少數動物和真菌中也有報道。MADS的名字起源于4類MADS-box基因，即釀酒酵母的MCM1、擬南芥的AGAMOUS、金魚草的DEFICIENS及人類的SRF4的首字母。MADS-box基因的功能貫穿于植物的整個生長發育過程，包括根結構的形成[1]，花分生組織的形成和開花[2]，植物光合作用和營養代謝[3]，激素信號的轉導[4]，果實的生長發育和成熟[5-6]。

MADS-box轉錄因子通過與DNA或蛋白質相互作用來調控植物的生長和發育過程[7]。早期在番茄中對MADS-box轉錄因子的研究發現TM6和TM3存在相互作用[8]。在擬南芥中AGAMOUS（AG）與MADS-box中4個蛋白AGL2（SEP1）、AGL4（SEP2）、AGL6和AGL9（SEP3）存在相互作用[9]。Brambilla等[10]在擬南芥中發現SEP和BEL1能夠形成二聚體，調控著子房的發育。另外，MADS-box蛋白還可以跟其它非MADS-box蛋白相互作用，如與組氨酸折疊蛋白NF-YB相互作用[11]。Hsu WH等[12]發現AGL13促進和調控花粉和胚珠的發育。Dong T等[13]在番茄中發現MADS-box轉錄因子SIMADS1對果實的成熟起到了負調控的作用。盡管在這些方面已經有了很多的研究，但是關于MADS-box的調控機理卻知之甚少。

雖然酵母雙雜交被應用于很多種植物來研究蛋白質之間的相互作用，但是這種技術在香蕉上的應用很少。筆者從香蕉果實的抑制差減文庫中分離了1個D類MADS-box基因，命名為MuMADS1，該基因主要在不同發育階段的子房中表達，在果實中的表達量很大程度上受外源乙烯的誘導，并且促使乙烯的生物合成和果實的成熟[14]。將其連接到誘餌載體（pGBKT7）上，通過酵母雙雜交實驗，獲得了1個泛素激酶E1的基因片段，并將此基因片段命名為MuUBA。對MuMADS1和MuUBA在香蕉不同組織、果實發育的不同時期以及不同處理條件下的表達特性也進行了研究。研究結果將有助于更好地了解MADS-box基因在香蕉果實發育和成熟過程中的調控機理。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

香蕉（Musa acuminata L. AAA group，cv. Brazilian）取自中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所香蕉基地（澄邁，海南）綠熟期（開花后100～110 d）的果實。挑選具有相似生長發育階段的香蕉，并且從每把香蕉上取5個香蕉指，分成3組進行不同的處理。其中一組讓其自然成熟，第2組用濃度為100 μL/L的乙烯處理12 h，最后一組用濃度為1 μL/L的1-甲基環丙烯（1-MCP）（乙烯抑制劑）處理12 h[15]。處理后的材料放在25 ℃的環境中成熟，選取不同成熟期的果實在液氮中速凍后，儲存在-80 ℃冰箱中備用。

1.2 酵母雙雜交

酵母雙雜交根據MATCHMAKERTM GAL4雙雜交系統3（Clontech，http：//www.clontech.com/）試劑盒進行。采用PCR技術獲得含MuMADS1基因的開放閱讀框，引物分別是P1： 5-CGGAATTCGAT

GGGAAGGGGTAAGAT-3，P2： 5-CGGTCGACTCAC

GCCGCTGAATCCGC-3。PCR產物用EcoRⅠ and SalⅠ進行酶切，然后克隆到具有EcoRI-SalI酶切位點的誘餌載體pGBKT7上，然后進行免疫檢測。同時，根據生產廠家的說明，用采后2 d的香蕉果實總RNA來構建cDNA文庫（Clontech，http：//www.clontech.com/）。隨后將構建的誘餌載體和cDNA文庫共同轉入酵母細胞，總共獲得1.5×106個酵母轉化株。

1.3 MuUBA的克隆和序列分析

將酵母雙雜交技術獲得的單克隆于不同營養缺陷型的培養基SD/-Leu/-Trp、SD/-His/-Leu/-Trp、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp+x-a-gal上進行篩選。用長鏈PCR引物擴增得到泛素激酶E1的片段，所用的引物如下，P1： 5-CTAT

TCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3，P2： 5-

GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3。PCR反應條件為：94 ℃ 1 min，94 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，30個循環。得到的PCR產物克隆到PMD-18T（購自TaKaRa公司）載體并進行測序，BLAST（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast）進行序列比對，采用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預測保守結構域。

1.4 RNA的提取和cDNA的合成

使用CTAB法[16]從香蕉的根、莖、葉、花、果實和不同發育階段的子房以及不同處理條件下的果實中提取總RNA。cDNA第一鏈的合成使用了SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit試劑盒（Clontech，Palo Alto，CA，USA），根據試劑盒說明進行反轉錄。

1.5 熒光實時定量PCR

2 結果與分析

2.1 酵母雙雜交分離得到MuUBA

酵母雙雜交篩選到的泛素激酶E1的片段大小為389 bp，命名為MuUBA（圖1-A）。生物信息學分析結果表明，MuUBA在它的C末端具有保守結構域KVVDLVAKVEDVVVACEDE-DVDIPL-SIYFR，屬于UBA家族中的一員（圖1-B）。

2.2 MuMADS1和MuUBA在香蕉不同組織和果實發育的不同階段中的表達

RT-PCR分析結果表明，MuMADS1和MuUBA都是在子房發育的第4階段（Ov4）表達量最高，這個階段是香蕉果實迅速生長發育時期。在Ov4時期，MuMADS1和MuUBA的相對表達量分別達到了7.59和12.94，在開花時期，它們的表達量分別為1.88和1.60。這兩個基因在莖中只有極少量的表達（圖2）。這些結果表明基因MuMADS1和MuUBA在不同的組織和果實發育的不同時期的表達具有協同性。

2.3 乙烯和1-MCP共同調控MuMADS1和MuUBA的表達

在自然成熟的香蕉果實中，MuMADS1和MuUBA的表達量是逐漸上升的，分別在采后的第12天和18天達到最高峰，然后下降（圖3-A）。在外源乙烯的處理下，MuMADS1和MuUBA的表達量迅速上升，達到峰值10.69和169.78，與自然成熟的果實相比提前了7 d和16 d（圖3-B）。在1-MCP的處理下，MuMADS1和MuUBA的表達都強烈地受到了抑制，只保持在一個很低的表達水平（圖3-C）。結果表明，MuMADS1和MuUBA可能共同參與乙烯對果實成熟過程的調控。

3 討論與結論

在不同的真核生物中，MADS-box蛋白是作為一類轉錄因子存在的，它在植物的生長發育過程中起到了很重要的作用，這種作用是通過與其它蛋白質形成同源或者異源二聚體或者蛋白復合物而實現的[7]。前期的研究結果表明，MuMADS1主要在發育的子房中大量表達，在根中也有少量的表達，并且與乙烯的生物合成途徑和果實的成熟過程密切相關[12]。同時，香蕉果實的成熟和大量基因的表達都起始于采后第2天[17]，因此，本研究以香蕉MuMADS1為誘餌，采用酵母雙雜交技術從采后2 d果實的獵物cDNA文庫中分離到了泛素激酶E1的基因片段，命名為MuUBA。MuUBA含有UBA家族中的保守序列，這些結構是與它所具有的激活功能密切相關的（圖1）。

泛素蛋白在很多生物途徑中起到了至關重要的作用，如細胞的生長、植物激素應答的信號轉導途徑、光合作用等[18-20]。泛素化途徑水解目標蛋白時，首先在目標蛋白之間通過形成一個硫酯鍵，在泛素激活酶E1的活躍位點上存在1個半胱氨酸，這樣可以激活泛素[21]。E1酶催化ATP耦聯激活反應中關鍵的第一步，通過定位反應使得泛素蛋白和特異靶位點結合，其在識別靶蛋白泛素化過程中起到關鍵作用[22]。本研究發現MuMADS1和MuUBA的相互作用，表明由泛素介導的MADS-box蛋白降解過程可能參與MADS結構域蛋白水平的調節。

對這兩個蛋白質在轉錄水平方面的表達特性進行了進一步的研究（圖2），MuMADS1和MuUBA在子房發育的第4個階段都有很高的表達量，也就是香蕉果實迅速生長的階段，但是在根和莖中的表達量卻很低。這個結果與文獻[14]報道過的MuMADS1在子房中表達量高，在根莖中的表達量低的結果相一致。該實驗結果也表明MuMADS1和MuUBA在不同的組織和果實的不同發育時期中的表達具有協同一致性。

香蕉是一種典型的躍變型果實，其成熟過程在很大程度上受到外源乙烯的促進及1-MCP的抑制作用，1-MCP作為乙烯的競爭性抑制劑，競爭性結合乙烯受體[15]。本研究中，當用外源乙烯處理香蕉果實時MuMADS1及MuUBA的表達水平都極大增加，并且發現相對于自然成熟的果實分別提前7 d和16 d達到表達高峰。經過1-MCP處理，MuMADS1及MuUBA表達大大受到抑制，在采后0～25d后沒有出現明顯的表達高峰。這種變化同香蕉果實成熟過程是一致的，表明MuMADS1和MuUBA的表達受外源乙烯共同調節，其在香蕉果實成熟中具有關鍵作用。另外，本研究結果表明，MuUBA對于乙烯信號的響應速度比MuMADS1快（圖3）。基于這兩種蛋白相互作用的研究結果，筆者推測MuUBA可以通過翻譯后修飾作用來調節MuMADS1的表達。

參考文獻

[1] Benlloch R， Roque E， Ferrándiz C， et al. Analysis of B function in legumes： PISTILLATA proteins do not require the PI motif for floral organ development in Medicago truncatula[J]. Plant J， 2009， 60： 102-111.

[2] Ferrario S， Shchennikova A V， Franken J， et al. Control of floral meristem determinacy in Petunia by MADS box transcription factors[J]. Plant Physiol， 2006， 140： 890-898.

[3] Mara C D， Irish V F. Two GATA transcription factors are downstream effectors of floral homeotic gene action in Arabidopsis[J]. Plant Physiol， 2008， 147： 707-718.

[4] Kaufmann K， Muin～o J M， Jauregui R， et al. Target Genes of the MADS Transcription Factor SEPALLATA3： Integration of Developmental and Hormonal Pathways in the Arabidopsis Flower[J]. PLoS Biol， 2009， 7： 854-875.

[5] Vrebalov J， Ruezinsky D， Padmanabhan V， et al. A MADS-box gene necessary for fruit ripening at the tomato ripening-inhibitor（rin）locus[J]. Science， 2002， 296： 343-346.

[6] Seymour G B， Ryder C D， Cevik V， et al. A SEPALLATA gene is involved in the development and ripening of strawberry （Fragaria X ananassa Duch.）fruit， a non-climacteric tissue[J]. J Exp Bot ， 2011， 62： 1 179-1 188.

[7] Tonaco I A N， Borst J W， de Vries S C， et al. In vivo imaging of MADS-box transcription factor interactions[J]. J Exp Bot， 2006， 57： 33-42.

[8] Pnueli L， Abu-Abeid M， Zamir D， et al. The MADS box gene family in tomato： temporal expression during floral development， conserved secondary structures and homology with homeotic genes from Antirrhinum and Arabidopsis[J]. Plant J， 1991， 1： 255-266.

[9] Fan H Y， Hu Y， Tudor M， et al. Specific interactions between the K domains of AG and AGLs， members of the MADS domain family of DNA binding proteins[J]. Plant J， 1997， 12： 999-1 010.

[10] Brambilla V， Battaglia R， Colombo M， et al. Genetic and Molecular Interactions between BELL1 and MADS Box Factors Support Ovule Development in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2007， 19： 2 544-2 556.

[11] Masiero S， Imbriano C， Ravasio F， et al. Ternary Complex Formation between MADS-box Transcription Factors and the Histone Fold Protein NF-YB[J]. J Biol Chem， 2002， 277： 26 429-26 435.

[12] Hsu W H， Yeh T J， Huang K Y， et al. AGAMOUS-LIKE13， a putative ancestor for the E functional genes， specifies male and female gametophyte morphogenesis[J]. Plant J， 2013， doi： 10.1111/tpj.12363.

[13] Dong T， Hu Z， Deng L， et al. A Tomato MADS-Box Transcription Factor， SlMADS1， Acts as a Negative Regulator of Fruit Ripening[J]. Plant Physiol， 2013， 163： 1 026-1 036

[14] Liu J， Xu B， Hu L， et al. （2009）Involvement of a banana MADS-box transcription factor gene in ethylene-induced fruit ripening[J]. Plant Cell Rep， 2009， 28： 103-111.

[15] Liu X， Shiomi S， Nakatsaka A， et al. Characterization of ethylene biosynthesis associated with ripening in banana fruit[J]. Plant Physiol， 1999， 121： 1 257-1 265.

[16] Wan C Y， Wilkins T A. A modified hot borate method significantly enhance the yield of high-quality RNA from cotton（Gossypium hirsutum L.）[J]. Anal Biochem， 1994， 223： 7-12.

[17] Xu B Y， Su W， Liu J H， et al. Differentially expressed cDNAs at the early stage of banana ripening identified by suppression subtractive hybridization and cDNA microarray[J]. Planta， 2007， 226： 529-539.

[18] Bai C， Sen P， Hofmann K， et al. SKP1 Connects Cell Cycle Regulators to the Ubiquitin Proteolysis Machinery through a Novel Motif， the F-Box[J]. Cell， 1996， 86： 263-274.

[19] Pickart C M. Mechanisms underlying ubiquitination[J]. Annu Rev Biochem， 2001， 70： 503-533.

[20] Devoto A， Muskett P R， Shirasu K. Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens[J]. Curr Opin Plant Biol， 2003， 6： 307-311.

[21] Hershko A， Ciechanover A. The ubiquitin system[J]. Annu Rev Genet， 2004， 67： 425-479.

[22] Takahashi H， Nozawa A， Seki M， et al. A simple and high-sensitivity method for analysis of ubiquitination and polyubiquitination based on wheat cell-free protein synthesis[J]. BMC Plant Biol， 2009， 9： 39.