薄皮甜瓜離體再生體系的優化

付秋實等

摘 要： 通過器官發生途徑誘導形成不定芽，建立薄皮甜瓜‘IVF05 植株再生體系，探討不同外植體及不同的激素組合對不定芽再生的影響。結果表明，子葉近胚軸端外植體的不定芽再生率為 90.00%，子葉節的再生率為 85.00 %，子葉遠胚軸端外植體的再生率為 31.43%，下胚軸的再生率為 0，子葉近胚軸端是‘IVF05不定芽分化的理想的外植體。不定芽誘導中最適宜的培養基為 MS + ABA 0.5 mg·L-1 + 6-BA 1.0 mg·L-1，在此培養基上產生的愈傷較少，能正常分化的不定芽較多，不定芽的生長較快。在 MS + 6-BA 0. 05 mg·L-1 的不定芽伸長培養基上，分化的不定芽能夠伸長長大。在 MS + IAA 0. 2 mg·L-1 的生根培養基上無根苗容易生根。從外植體培養到獲得完整再生植株需 50～60 d。

關鍵詞： 薄皮甜瓜； 離體再生； 子葉； 6-BA； ABA

Abstract： An efficient regeneration system of plantlets was established for melon（Cucumis melo L. ‘IVF05）. We investigated the influence of explant type and plant growth regulator combinations on regeneration rate of adventitious buds in this research. The results showed that the adventitious buds regeneration rates of cotyledon explants near the hypocotyl，cotyledonary nodes，cotyledon explants far from hypocotyl and hypocotyl were 90.00%，85.00%，31.43% and 0，respectively. Cotyledon explants near the hypocotyls were the optimal explants. The optimal concentrations of plant growth regulators were 0.5 mg·L-1 ABA plus 1.0 mg·L-1 6-BA. The buds elongation medium was MS + 6-BA 0.05 mg·L-1. The rooting medium was MS + IAA 0.2 mg·L-1. It took about 50 to 60 days from explants culture to obtain complete regeneration plant.

Key words： Oriental melon； Plant regeneration； Cotyledon； 6-BA； ABA

甜瓜（Cucumis melo L.）是世界重要的經濟作物。隨著生活水平的提高，人們越來越重視其產量和品質。近年來隨著植物基因工程技術的迅速發展，運用生物技術手段進行種質創新，改良甜瓜品質已經成為甜瓜遺傳育種研究的新途徑。甜瓜高效再生體系的建立， 對于進一步進行甜瓜功能基因鑒定、轉基因等方面的研究十分必要。目前已有通過真葉[1]、子葉[2-5]、下胚軸[6]等多種外植體再生完整植株的報道，但是研究主要集中在厚皮甜瓜上[7-11]，對薄皮甜瓜的研究較少，我國有豐富的薄皮甜瓜種質資源，對薄皮甜瓜的遺傳改良具有較大潛力。而且不同的甜瓜品種以及不同生長調節劑組合對甜瓜離體再生體系的建立影響較大，再生潛力依基因型而明顯不同[12]。在前人的研究中，采用外植體直接器官發生途徑時，一般在培養基中僅添加細胞分裂素或極少量生長素[13-14]。6-BA 作為一種細胞分裂素，在促進細胞分裂和不定芽發生方面具有很好的效果[15-17]。前人以子葉作外植體，6-BA 為主要誘導激素，輔之以 ABA，通過器官直接發生途徑，建立了不同基因型黃瓜子葉的再生體系[18-20]。前人在黃瓜上的研究結果表明，6-BA 是不定芽分化所必需的，而 ABA 能明顯提高芽的分化速度和不定芽數目。甜瓜也屬于葫蘆科作物，但是關于 ABA 對甜瓜離體再生的影響還未見報道。因此本文以薄皮甜瓜 ‘IVF05 為材料，研究了不同外植體、不同 6-BA 與 ABA 組合對其離體再生的影響，旨在建立高效的薄皮甜瓜離體再生體系，以期為甜瓜轉基因技術以及培育優良的薄皮甜瓜品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為薄皮甜瓜 ‘IVF05，由中國農業科學院蔬菜花卉研究所甜瓜課題組選育。

1.2 方法

2.1 不同外植體對不定芽誘導的影響

外植體的部位是離體培養時的關鍵因素。3 結論與討論

外植體的選擇是進行組織培養及植株再生的關鍵。師桂英等[21]研究表明，厚皮甜瓜‘黃河蜜的極性現象不受外植體切割方式和切塊大小的影響，而與子葉外植體的切口位置有關，靠近胚軸的切口容易產生不定芽，遠離胚軸的切口難以形成不定芽。子葉近胚軸部位的子葉塊不定芽的誘導率高于遠離胚軸端的子葉塊，多數不定芽都是在靠近胚軸端的子葉塊中產生。本試驗中也表明最適宜作為薄皮甜瓜組織培養的外植體材料為子葉近胚軸端，其不定芽誘導率在 90% 以上。通過子葉近胚軸端直接誘導不定芽途徑，成苗時間短，能快速建立起甜瓜的高頻穩定再生體系，這與王志強等[22]、陶興林等[12]試驗結果一致。

雖然甜瓜子葉節也有較高不定芽分化率，但前人的研究結果表明，子葉節去除生長點之后，由于生長點周圍細胞分裂旺盛，即使未接觸芽誘導培養基，仍然會有不定芽的生長[23]。不論是加入還是不加入6-BA，每個子葉節幾乎都可以誘導出不定芽，增加6-BA的質量濃度可以增加叢生芽的分化數量。在子葉節基部除不定芽分化外，還有大量叢生畸形葉生長，無生長點，不能進一步培養成正常植株[24]。若在遺傳轉化選擇培養階段，由于生長點部位不能完全接觸選擇培養基，此部位分化出的不定芽得到許多假陽性植株，從而加大后續工作量。

6-BA是甜瓜再生分化的關鍵物質。本試驗中不定芽誘導最適6-BA質量濃度為1.0 mg·L-1。在誘導不定芽的增殖生長中，加入較高質量濃度的6-BA，雖然對芽的分化有促進作用，但是容易產生叢芽，同時還發現分化出的叢生芽中存在大量簇生畸形葉（圖1-B），無明顯生長點，即使進一步培養也不能長成正常植株，并且外植體有黃化現象，這與孫天國等[25]的研究結果一致。因此在繼代過程中適當降低細胞分裂素濃度對芽的正常生長是有利的。同時，還應該及時轉移分化完全的不定芽至伸長培養基上，避免外植體在含有高濃度激素的芽誘導培養基上停留時間過長。

本試驗中 ABA 對甜瓜子葉的芽分化也有促進作用，6-BA和ABA的不同配比影響甜瓜子葉不定芽的分化，不定芽誘導中最適宜的激素組合為MS+ABA 0.5 mg·L-1 +6-BA 1.0 mg·L-1，在此培養基上產生的愈傷較少，能正常分化的不定芽較多并明顯伸長，不定芽的生長較快（表2，圖1-A）。在只添加2.0 mg·L-1 6-BA的培養基上，外植體表現為輕度黃化（圖1-B）。添加ABA是多種難以再生植物組織培養的有效措施，應用到黃瓜組培上也獲得相似的結果，以黃瓜子葉作外植體，6-BA為主要誘導激素，輔之以ABA，通過器官直接發生途徑，建立了不同基因型黃瓜子葉的再生體系。李泠等[20]報道，ABA在黃瓜再生中起到了重要的作用，與激動素相配合能促進植株分化，并能抑制異常胚狀體，促進正常胚狀體的發生。梅茜和張興國[19] 研究也表明，在培養基中添加ABA可明顯提高黃瓜的芽再生能力，且以 1.0 mg·L-1 為最適宜，如果不添加ABA，則很難產生不定芽。Sekioka等 [26] 的研究表明在黃瓜的組織培養中，低質量濃度的 ABA（0.1 mg·L-1）促進胚狀體的正常發育，而高質量濃度的ABA（1.0 mg·L-1）能顯著減少培養物的愈傷組織化，并控制胚狀體處于球形胚或球形胚后期。Han等[27] 研究認為，添加ABA可明顯提高芽誘導率，6-BA和ABA的組合可適用于不同的黃瓜品種。從激素的影響效應來說，6-BA屬于細胞分裂素類，對植物的生長分化起促進作用，而ABA是一種生長抑制劑，可能兩者對于維持外植體的激素平衡起到了重要作用，相關機理需進一步作研究。因此，在植物組織培養研究中，選擇合適的激素及其配比濃度是獲得再生植株的關鍵。

本試驗中將誘導的不定芽轉入伸長培養基中（MS + 6-BA 0.05 mg·L-1），分化的不定芽能夠伸長長大，在生根培養基中（MS + IAA 0.2 mg·L-1） 容易生根。從外植體培養到獲得完整再生植株需 50～60 d，建立了薄皮甜瓜遺傳轉化和快繁的子葉再生體系。

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