應用SSR分子標記技術鑒定張氏紅山茶雜交F1代真實性的研究

李琳琳等

摘要 ：張氏紅山茶Camellia changii是新興的山茶屬珍稀種質資源，在茶花雜交育種方面具有極高的科研價值。為建立鑒定張氏紅山茶雜交后代的方法，本研究采用SSR標記技術，對以張氏紅山茶為親本的雜交后代以及所有雜交組合的親本進行了分子鑒定。研究結果顯示 ：張氏紅山茶和博白大果油茶雜交后代僅有母本特征帶，推測其有可能是自交種；張氏紅山茶和超級南天武士的雜交后代出現了父母本均沒有的條帶，顯示可能有外來血緣；其余組合雜交F1代均包含了父母本的特征帶，從而表明雜交是成功的。從本研究結果看，應用SSR分子標記技術，可以方便地對雜交后代的真實性進行鑒定。

關鍵詞：張氏紅山茶；SSR分子標記；雜交一代鑒定

中圖分類號：Q37 ；S688

文獻標識碼：A

文章編號：1671-2641（2014）02-0000-00

Abstract： Camellia changii， a emerging and rare germplasm resources of the genus Camellia， has very high scientific research value in the research field of hybridize breeding. In order to establish a verity identification method of hybrid from Camellia changii， ten F1 hybrids derived from Camellia changii were identified by Simple Sequence Repeat （SSR） markers. The results showed that hybrid derived from combination of C. changii × C. gigantocarpa only merged specific band as female parent， it might be self –bred progeny；hybrid derived from combination of C. changii and C. japonica ‘Dixie Knight Supreme showed no similar band as parents， it might be exogenous consanguinity ， all the other F1 hybrids merged specific bands as parents， it indicate hybridization is successful. Based on the result， verity identification of hybrids could be conveniently carried out by SSR molecular makers.

Key words： Camellia changii； SSR molecular makers； identification of hybrid F1

山茶屬植物是著名的茶葉和食用油料資源，也是國際園藝界公認的著名木本花卉，本屬的山茶Camellia japonica即為我國的十大名花之一，目前，世界上山茶屬植物種類已有280個左右，其中80%以上產于我國，可是作為觀賞植物栽培的種類并不多，最常見的有山茶C.japonica、滇山茶C.reticulata、茶梅C.sasanqua、西南紅山茶C.pitardii、怒江紅山茶C.saluenensis等，并由此選育出上萬種觀賞茶花品種，在眾多育種方法中，雜交育種最重要，據統計，全世界80%以上的茶花品種是通過授粉獲得的。尋覓更加與眾不同、具有觀賞價值的茶花原種來培育新的品種，是茶花育種工作者目前的主要研究工作之一。我國作為山茶屬的現代分布中心，茶花植物種質資源相當豐富，其中張氏紅山茶Camellia Changii是新近受到重視的珍稀種質資源，它樹形優美，枝密花繁，葉光亮全緣，花色鮮紅，一年多次開花，不同于其他的茶花品種，成為茶花園藝界熱烈追捧的新栽培對象。通過雜交育種改造張氏紅山茶花型花色的工作已經開始，對其雜種后代的真實性進行鑒定和評價就顯得非常重要。

傳統常采用形態學鑒定方法進行雜種鑒定，依靠植株的表型性狀來鑒別不同的個體比較直接簡便，但有些性狀要在特定的生育期才能觀測到，時間周期長，有些性狀易受環境條件影響，且在對親緣關系較近的個體的檢測上存在不足。近年來廣泛應用的分子標記鑒定方法彌補了這方面的不足。合理利用分子標記技術，對品種的真實性進行鑒定，從分子水平上獲得最直接的證據，具有準確、快捷、可靠的優點。SSR（Simple Sequence Repeat） 又稱微衛星DNA，是目前優秀的遺傳標記技術之一，其以信息含量高、顯共顯性遺傳、擴增帶型易區分、重復性好等優點，已被廣泛用于玉米[1]、棉花[2]、月季[3]等品種純度和真偽性的鑒定中。在山茶屬相關植物研究中，RAPD[4-5]、ISSR[6-7]、AFLP[8-9] 等分子標記已成功應用于親緣關系鑒定、遺傳分析等，然而SSR分子標記技術的成功應用則鮮有報道。

本研究采用SSR分子標記技術對來自張氏紅山茶的雜交F1代的真實性進行鑒定分析，以期為張氏紅山茶選育種及深入研究張氏紅山茶生殖遺傳和分子機制提供科學依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為廣東棕櫚園藝股份有限公司培育的F1代幼苗。用于本研究的植物材料及其來源見表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 新鮮材料經變色硅膠充分干燥后采用改進的CTAB法[15]進行總DNA提取。

1.2.2 PCR 擴增 經篩選獲得兩對引物分別為：引物MSCjaH38（5 → 3）：F： TATTGCCTACGACCATTTCCA，R： TTTGAGTTCGTTGCCTTCTCT，引物MSCjaH46（5 → 3）F：AAGAAGAGCAGAGCAACAAGTG，R：CCACACACTTTCCACACTTTTG。擴增程序為：94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min，30個循環，72℃ 5min。PCR反應在PTC-200儀器上完成。

1.2.3 PCR產物的檢測 以10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，在800V電壓下電泳6～7 h檢測PCR擴增產物。電泳結束后聚丙烯酰胺以10%的冰乙酸固定10 min，雙蒸水漂洗一次，0.2%的硝酸銀銀染10 min，經雙蒸水漂洗一次，以30%的NaOH和5mL37%甲醛顯影，至條帶清晰為止，最后用10%冰乙酸固定液終止顯影，凝膠以雙蒸水漂洗兩次，過夜風干后進行掃描。

1.2.4 SSR帶譜中F1代真實性鑒定標準 母本來自張氏紅山茶的雜交組合后代，在某一引物的SSR帶譜中，如果所出現的條帶具有父本的特征帶，判斷為真雜種；如果所出現的條帶沒有父本的特征帶只具有母本的特征帶，判斷為自交種；如果出現父本和母本均沒有的雜帶，則認為有外來血緣，判斷為假雜種[11～12]。

2結果與分析

由引物MSCjaH38對各親本和雜交一代的樣品進行PCR擴增的結果可以判斷：張氏紅山茶與紅花瘤果茶的F1代、張氏紅山茶與浙江紅山茶的F1代、媚麗與張氏紅山茶的F1代這3個為其真實后代，電泳圖譜上顯示其子代具有父母雙親的特征帶；張氏紅山茶與博白大果油茶的F1代和母本帶型大小都一致，且不具有父本特征帶，有可能為自交種；張氏紅山茶和超級南天武士的后代出現了父母本均沒有的雜帶，認為可能有外來血緣；其他組合父母本與子代僅有數個堿基的差別（圖1～2）。

由引物MSCjaH46對各親本和雜交一代的樣品進行PCR擴增的結果可以判別：張氏紅山茶與博白大果油茶的F1代僅具有母本的特征帶，判斷為自交種；張氏紅山茶與超級南天武士的F1代出現了父母本均沒有的雜帶，判斷可能有外來血緣；其他組合均可以從電泳圖譜上看出其F1代具有父母雙親的特征帶，為其真實的雜交后代（圖3～4）。

引物MSCjaH38和引物MSCjaH46結果的相互印證表明：大部分雜交后代具有雙親的特征帶，為其真實的后代；而張氏紅山茶與博白大果油茶的雜交后代無論從引物MSCjaH38還是引物MSCjaH46的擴增結果來看，均顯示與母本相同的條帶，因此判斷其為自交種，雜交沒有成功；張氏紅山茶與超級南天武士的雜交后代從引物MSCjaH38和 MSCjaH46的擴增結果來看均出現了父母本所不具有的條帶，即出現所謂的“新帶”，原因可能是在減數分裂形成配子體過程中，染色體減數分裂時同源染色體發生配對與交換，或者染色體復制過程中存在堿基發生突變等。因此，出現一些新的條帶，并不必然意味著雜交沒有成功，而應通過多對引物的聯合分析進一步判斷。

3 討論

3.1 分子標記技術及引物的篩選

通過雜交選育新品種，必須對雜交后代進行真實性的鑒定，這是進一步研究的基礎。分子標記是DNA水平上的遺傳多態性，受外界環境影響較小，廣泛應用于植物種質鑒定、遺傳圖譜構建、目的基因定位、分子標記輔助育種等領域，并發揮著重大的作用。目前已經發展了幾十種標記技術，各標記具有不同的優缺點。本研究首先考慮到ISSR分子標記技術通用引物的優點，采用ISSR分子標記技術對雜交后代的真實性進行鑒定，并挑選出10對擴增良好的引物，但由于其擴增條帶數目較多，且呈顯性標記，不能鑒定出雜合基因型，而不利于比較分析。因而選擇了呈共顯性、具有豐富的多態性、且重復性和穩定性好的SSR分子標記技術。SSR的最大優點在于它通過簡單的PCR反應即可直接檢測到已知的DNA特定染色體位點，而避免使用放射性同位素[13～14]。從相關文獻中查到的20對引物中篩選到兩對擴增良好的引物[15～17]，能同時擴增出父本和母本的特征帶，可用于本研究的雜種鑒定。

3.2 SSR分子標記技術在張氏紅山茶雜種真實性鑒定中的應用前景

本研究通過篩選的2對SSR引物，對以張氏紅山茶為親本的F1代雜種進行了鑒定，結果表明：除2個組合外，其余均為真雜種。此外，通過形態觀測發現，真雜種在形態特征上更接近于父本，但葉的寬度和鋸齒特征明顯受到母本的影響，由此可見，形態學性狀可對雜交后代進行初步鑒定；但對于自交的假雜種，因其形態性狀與母本完全一致，無法準確判斷其雜種真實性，必須通過分子標記來進一步鑒定。至于鑒定為真雜種的后代是否在花色上兼具了親本的優良性狀，則有待進一步實驗研究。

本文應用SSR分子標記技術成功鑒定了來自張氏紅山茶的雜種真實性，這是該技術首次在山茶屬種質鑒定中的成功運用。從SSR分析結果中可以看出，SSR分子鑒定的結果條帶清晰、穩定、可靠。可為張氏紅山茶選育種及深入研究張氏紅山茶生殖遺傳和分子機制提供科學依據和技術支持，也將為山茶屬植物中雜種的鑒定及其遺傳分析應用奠定良好的基礎。

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