內質網應激蛋白在慢性乙肝患者外周血單個核細胞中表達水平的研究*

周艷萌，劉 霜，李 瀅，馮正軍，向文安，盧 濤，宋 鴻

(1.遵義醫科大學基礎醫學院，貴州 遵義 563000；2.遵義醫科大學，貴州 遵義 563000；3.遵義醫科大學第一附屬醫院感染科，貴州 遵義 563000；4.遵義醫科大學第三附屬醫院內科，貴州 遵義 563000；5.遵義市正安縣中醫院口腔科，貴州 遵義 563000；6.遵義市婦幼保健院藥劑科，貴州 遵義 563000)

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的疾病，全球HBV慢性感染者超過2.4億人。據估計，每年有超過88.7萬人死于嚴重的肝病，包括肝硬化和肝細胞癌(HCC)。HBV感染引起的內質網應激(ERS)可能通過炎性反應、氧化應激介導的DNA損傷和肝細胞增殖等途徑參與慢性炎癥的肝臟癌變和疾病進展[1]。內質網是細胞內蛋白合成后修飾、折疊的重要場所。在病理條件下，如突變蛋白的過表達和(或)分泌蛋白合成的過負荷，未折疊或錯誤折疊的蛋白在內質網內積聚，這被稱為ERS[2]；內質網蛋白質穩態的監測則是由未折疊蛋白反應(UPR)介導的，UPR是一種信號轉導途徑，可感知內質網管腔中蛋白質折疊的保真度[3]。許多研究報道，在HBV感染的細胞的內質網中存在大量病毒蛋白，這些超載的蛋白導致了ERS，進而導致肝硬化、HCC等嚴重肝病的進展[4-7]，ERS在重型肝炎肝衰竭發病的過程中起到重要又復雜的作用，但是由于取肝臟組織危險系數高且不易被患者接受，因此具體機制的研究受到一定限制。HBV是一種泛嗜性病毒，最近研究發現，HBV可感染外周血單個核細胞(PBMCs)并在其中復制，在PBMCs 中檢測到了病毒RNA轉錄的模板ccc HBV DNA，所有的PBMCs均有HBV RNA[8-10]。CHB患者PBMCs中的ERS與其疾病進程的關系尚鮮見報道。本研究通過收集的輕、中、重度CHB患者的PBMCs，檢測PBMCs中ERS蛋白GRP78、GRP94及CHOP的變化，并分析其與CHB患者病情嚴重程度的相關性，為臨床預測CHB患者病情的發展提供實驗參考。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1檢測對象 以2016—2017年就診于遵義醫科大學第一附屬醫院、遵義市婦幼保健院、遵義醫科大學第三附屬醫院、遵義市正安縣人民醫院及中醫院的CHB患者為研究對象，所有CHB患者依據《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[11]進行診斷和分度，共分別收集到30例輕度、25例中度及25例重度CHB患者外周血，同時收集35例健康體檢者外周血。所有CHB患者的甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)、巨細胞病毒(CMV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體均陰性，采集標本均在患者知情情況下進行，同時簽署了知情同意書并獲得醫院倫理委員會批準。

1.1.2實驗材料 淋巴細胞分離液購自四海生物公司，聚合酶鏈式反應(PCR)擴增試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術公司，SDS-PAG凝膠試劑盒和β-actin一抗購自北京索萊寶科技有限公司，GRP78一抗、GRP94一抗及CHOP一抗購自美國abcam公司，山羊抗小鼠二抗購自美國proteintech公司。PCR擴增儀、熒光定量PCR儀、全自動凝膠成像分析系統、SDS-PAGE電泳系統和SDS-PAGE電轉系統購自美國BIO-RAD公司，低溫高速離心機購自美國Beckman Coullter公司。

1.2方法

1.2.1收集三組患者基線特征資料 包括患者性別、年齡、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、清蛋白(ALB)、凝血酶原活動度(PTA)。

1.2.2淋巴細胞收集 采用密度梯度離心法收集三組患者的PBMCs。

1.2.3PBMCs中ERS蛋白的核酸表達水平檢測 根據TRNzol總RNA提取試劑盒的步驟提取分離的PBMCs中總RNA，然后按照PrimeScriptTMRT reagent Kit的操作將所提RNA逆轉錄成cDNA，最后根據SYBR?Fast qPCR Mix試劑盒的操作進行實時熒光定量PCR，反應條件：95 ℃、30 s；之后95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，39個循環，最后65 ℃、5s。通過公式計算基因相對定量2-ΔΔCt：相對定量=目的基因的表達量/內參基因的表達量×100。引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR中的引物序列

1.2.4PBMCs中ERS蛋白的蛋白表達水平檢測 采用western-blotting檢測GRP78、GRP94、CHOP在蛋白水平的表達量。將細胞裂解液加入分離的PBMCs中，以15 300 r/min、4 ℃離心5 min測定蛋白濃度，根據BCA結果加入蛋白上樣緩沖液，煮沸7 min使蛋白變性；取變性蛋白上樣、電泳、轉膜，加入1∶1000稀釋的一抗，4 ℃冰箱過夜，TBST洗滌5次，用1∶3 000稀釋的二抗，室溫、搖床孵育1 h，TBST洗滌5次，ECL顯色液A、B按1∶1體積比例混合，均勻覆蓋于膜上，避光室溫作用8 min，曝光。結果采用Quantity One定量分析系統進行灰度測定。

2 結 果

2.1三組CHB患者基線特征 本研究共納入80例CHB患者，輕度CHB患者中男16例，女14例，年齡18～24歲；中度CHB患者中男20例，女5例，年齡41～76歲；重度CHB患者中男21例，女4例，年齡23～66歲。輕度CHB患者的ALT、AST水平升高不明顯，說明肝細胞損傷不明顯；而中、重度CHB患者ALT、AST水平顯著升高，說明肝細胞損傷嚴重，見表2。

表2 三組CHB患者基線特征比較

2.2各組ERS蛋白的核酸表達水平比較 健康對照組及CHB輕、中、重度組GRP78、GRP94組間兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；且隨CHB患者病情的加重，GRP78、GRP94、CHOP的表達水平明顯升高，CHB輕度組CHOP表達水平與健康對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 CHB患者ERS蛋白的核酸表達水平比較

2.3CHB患者ERS蛋白的蛋白表達水平比較 western-blotting結果與qRT-PCR結果趨勢一致，CHB輕度組CHOP表達水平與健康對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，健康對照組及CHB患者輕、中、重度組GRP78、GRP94組間兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，且隨CHB患者病情的加重，GRP78、GRP94、CHOP的表達水平明顯升高，見圖1、表4。

表4 各組ERS蛋白的蛋白表達水平比較

1為健康對照組；2為輕度CHB組；3為中度CHB組；4為重度CHB組。

2.4ERS蛋白的核酸、蛋白表達水平與ALT、AST相關性分析 ERS蛋白GRP78、GRP94 和CHOP的核酸、蛋白水平相對表達量與CHB患者AST、ALT均呈正相關(P<0.05)，見圖2、3。

圖2 GRP78、 GRP94、CHOP蛋白的核酸水平相對表達量與AST、ALT相關性分析

圖3 GRP78、 GRP94、CHOP蛋白的蛋白水平相對表達量與AST、ALT相關性分析

3 討 論

HBV感染是一個全球性的公共衛生問題[12]，至少三分之一的肝硬化病例由 CHB發展而來，而很大比例的CHB患者最終進展為HCC[13]。在中國，大約有1億例HBV感染者和病毒攜帶者，三分之一患有CHB，每年約有50萬人因肝功能衰竭、肝硬化、肝細胞癌和HBV感染的其他并發癥而過早死亡[14]。ERS誘導了一個復雜的穩態信號通路，該通路可以維持生理平衡以保護細胞免受損傷。然而，長期的ERS可導致細胞凋亡，這也是許多疾病發病的重要因素[12]。當病毒感染細胞時，內質網容易受病毒復制和合成的病毒蛋白影響，大量的展開或錯誤折疊的蛋白質聚集在ER中引起ERS[15]。近幾年研究發現多種肝臟疾病的發生、發展及轉歸與ERS有關系，研究發現HBV、HCV等可誘導肝細胞的ERS反應，并與病毒復制、肝細胞損傷、肝癌的發生有關[7,16]。HBV是一個泛嗜性病毒，除肝細胞外還可以感染PBMCs和其他組織細胞。HBV的基因組可以以整合的形式存在于HBsAg陰性HBV患者的PBMCs中。MURAKAMI等[17]首次明確證實了HBV感染的急性期肝組織和PBMCs中有整合的病毒DNA。HBV-DNA也能在CHB患者血清和PBMCs中持續存在，整合到PBMC的DNA染色體中，并可在外周血單個核細胞中檢測到HBV轉錄[18]。GHARTAVOL等[19]發現隱匿性HBV感染者的PBMCs標本中HBV-DNA陽性檢出率高于血漿標本，HBV的cccDNA也能在PBMCs中被檢出，在不能檢測肝臟樣本中HBV-DNA的時候，血漿和PBMCs中HBV-DNA的檢測可以提供可靠的信息。作者前期研究也在CHB患者的PBMCs中檢出HBV-DNA，且外周血中HBV-DNA拷貝越高，PBMCs中HBV-DNA陽性率越高；同時也發現HBV-DNA可引起健康人PBMCs、GRP78、GR94和CHOP表達的增高[20]；而本研究中發現CHB患者PBMCs 中GRP78、GR94和CHOP在核酸、蛋白水平的表達隨病情加重而增高，進一步說明HBV可能是引起ERS的因素之一。在ERS的早期，PBMCs中GRP78、GRP94的高表達提示細胞內出現了ERS且觸發了UPR[21-23]，本研究CHB患者PBMCs中GRP78、GRP94水平升高可能是為了修復錯誤折疊或未折疊蛋白，從而保護PBMCs免受損傷。CHOP的高表達，則提示細胞凋亡通路被激活[24]，本研究CHB患者PBMCs中CHOP在基因水平和蛋白水平的表達隨病情加重而升高，輕度組低表達可能是由于PBMCs中雖然出現了ERS，但是通過UPR減少了蛋白質的錯誤折疊，ERS的穩態得到逐步恢復，此時凋亡通路尚未被激活。而在中、重度組PBMCs中由于ERS繼續加劇，大量聚集的錯誤折疊或未折疊的蛋白質不能得到及時修正和降解，從而使得凋亡通路被激活，出現CHOP的高表達。本研究也發現CHB患者PBMCs中GRP78、GRP94、CHOP與AST、ALT呈正相關，提示肝臟炎癥程度可能與ERS蛋白的變化存在一定的關系。

綜上所述，CHB患者PBMCs中的ERS可能與HBV感染和在PBMCs中的增殖有關，也與HBV病程中產生的炎癥有關，提示PBMCs中ERS參與了CHB感染后的疾病進程，但具體機制尚不明確。