塊菌菌根促棲菌研究

摘要

[目的]為了檢測細菌對塊菌菌根苗的菌根數量、株高和地徑的影響，尋找塊菌可能的NHBs。[方法] 設置5個菌根組合T. indicum × C. mollissima，T. indicum × Q. franchetii，T. aestivum × C. mollissima，T. aestivum × Q. franchetii和T. melanosporum × C. mollissima為供試菌根組合。選擇6株細菌蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、溶桿菌（Lysobacter capsici）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、瓜兩面神菌（Janibacter melonis）、氧化烴微桿菌（Microbacterium hydrocarbonoxydans）和球形節桿菌（Arthrobacter globiformis）作為供試細菌。在塊菌接種的過程中在菌劑中分別加入供試細菌和抗生素，在幼苗形成菌根后對菌根苗的菌根進行計數，并且測量株高和地徑。[結果] 蘇云金牙孢桿菌可以極顯著地促進Ti×Qf菌根苗的菌根數量和地徑，球形節桿菌極顯著地促進Tm×Cm菌根苗的菌根數量。這兩種細菌可以應用于實驗大棚接種。

[結論]

同一細菌對于不同的菌根組合形成的菌根數量、菌根苗株高和地徑具有真菌特異性。它會促進某些菌根組合的菌根數量、菌根苗株高和地徑形成，但會抑制另外一些菌根組合的菌根數量、菌根苗株高和地徑。同時，塊菌子囊果內土著細菌對于所有供試菌根組合形成的菌根數量都有顯著促進作用，但對于菌根苗株高和地徑的影響在不同組合中不一致。

關鍵詞塊菌；菌根；根際微生物；菌根促棲菌

中圖分類號S182文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）36-13179-06

Abstract[Objective]The objective was to test the influence of bacteria on mycorrhizal number， height and basal diameter of Tubermycorrhizaed seeding. [Method] Five mycorrhizal combinations， T. indicum × C. mollissima，T. indicum × Q. franchetii，T. aestivum × C. mollissima，T. aestivum × Q. franchetii and T. melanosporum × C. mollissima were synthesized. Six bacteria Bacillus thuringiensis， Lysobacter capsici， Bacillus cereus， Janibacter melonis， Microbacterium hydrocarbonoxydans and Arthrobacter globiformis were selected. Bacteria and antibiotic were added into inoculum respectively when mycorrhizal synthesis. After forming mycorrhizae， mycorrhizal number was counted， as well as height and basal diameter of seeding were measured.

[Result] Bacillus thuringiensis could promote mycorrhizal number and basal diameter of seedings of Ti × Qf significantly. Arthrobacter globiformis could promote mycorrhizal number of Ti × Qf seedings significantly. Bacillus thuringiensis and Arthrobacter globiformis were potential bacteria to be used in Tuberinoculated seedings. [Conclusion]Indigenous bacteria could promote the mycorrhizal formation of Tuber. Selected bacteria could promote mycorrhizal formation， height or basal diameter of seeding in one mycorrhizal combination， but inhibit in another mycorrhizal combination.

Key wordsTuber spp.； Mycorrhizae；Indigenous bacteria；Mycorrhization helper bacteria

大多數陸生植物的根系都會和菌根菌形成菌根。這是一種互惠共生的關系，在自然界中分布十分廣泛[1]。菌根真菌能否順利地侵染植物的根并且形成菌根，不僅取決于其周圍的非生物因素如土壤pH、肥力、濕度和溫度，而且取決于一些生物因素如土壤微生物[2]。菌根對其根際微生物有選擇和調節的作用，根際中的有些微生物也能促進菌根的形成和改變菌根菌的基因表達[3-4]。Duponnois等[5]從蠟蘑（Laccaria laccata）和黃杉（Pseudotsuga menziesii）形成的菌根上分離出細菌，在大棚里用黃杉接種蠟蘑，分別加入分離得到的45株細菌，發現4個月后有14株細菌都顯著地提高了菌根的侵染率，其中枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）使得菌根侵染率從67.3%提高至97.3%。他們把這些能夠促進菌根形成的細菌稱為菌根促棲菌（Mycorrhization Helper Bacteria， MHBs）。

MHBs普遍存在于外生菌根根際中，其重要特征就是具有其真菌特異性。MHBs經常會促進某些菌根組合的形成，但會抑制另外一些真菌形成菌根[6]。研究表明，熒光假單胞菌BBc6菌株可以顯著促進紅蠟蘑和北美黃衫形成菌根[5]，但同一株菌株顯著地抑制紅蠟蘑和加利桉樹菌根的形成[7]。

塊菌屬（Tuber F. H. Wigg.）是一類具有重要經濟和生態價值的子囊菌門地下生的外生菌根真菌。塊菌中的一些種類具有較高的營養價值和極高的經濟價值，如意大利白塊菌（T. magnatum Pico）、黑孢塊菌（T. melanosporum Vittad.）和印度塊菌（T. indicum Cooke & Massee）等。開發塊菌資源具有重要意義。到目前為止，塊菌還未實現人工栽培，現在塊菌栽培所采用的是半人工栽培（Semiartificial cultivation）的方法，其關鍵就是使得塊菌和寄生宿主之間形成菌根關系。在塊菌的半人工栽培過程中，關于影響菌根形成的非生物因素如pH、基質配比等已有很多的研究，但關于在塊菌形成菌根過程中根際微生物所扮演的角色至今尚無研究。所以，研究塊菌的MHBs具有很重要的應用價值。目前已有報道顯示，從波氏塊菌和意大利白塊菌（T. magnatum）的子囊果中分離出的細菌可以顯著促進塊菌菌絲的生長，它們中的大多數都是革蘭氏陰性菌[8-12]。但是，至今未發現有關促進塊菌菌根形成MHBs的報道。

1材料與方法

1.1研究材料

1.1.1供試菌根組合。

選擇冷凍儲藏的印度塊菌（T. indicum）、夏塊菌（T. aestivum Vittad.）和黑孢塊菌（T. melanosporum）作為該次試驗的菌劑，其中印度塊菌于2009年2月購于昆明水木花菌子市場，夏塊菌于2009年10月底購于四川會東縣，黑孢塊菌于2009年11月購于法國。

選擇板栗（Castanea mollissima）和錐鏈櫟（Quercus franchetii）幼苗作為寄主植物。供試板栗種子購買昆明市場，于2009年3月底育苗；供試錐鏈櫟種子采自于昆明植物所木本園內，于2009年10月31日育苗。

設置5個菌根組合菌：T. indicum × C. mollissima（Ti × Cm）， T. indicum × Q. franchetii（Ti × Qf）， T. aestivum × C. mollissima（Ta × Cm）， T. aestivum × Q. franchetii（Ta × Qf）和T. melanosporum × C. mollissima（Tm × Cm）。

1.1.2供試細菌。

2010年4月9日，取塊菌菌根際土壤，分離純化得到96株細菌。選擇其中6株細菌作為供試細菌，分別為B1（Bacillus thuringiensis，蘇云金芽孢桿菌）、B2（Lysobacter capsici，溶桿菌）、B3（Bacillus cereus，蠟狀芽孢桿菌）、B4（Janibacter melonis，瓜兩面神菌）、B5（Microbacterium hydrocarbonoxydans，氧化烴微桿菌）、B12（Arthrobacter globiformis，球形節桿菌）。

1.2研究方法

1.2.1供試細菌的分離純化和鑒定。

在發現塊菌菌根后，以其為中心，取半徑1 cm以內的土樣，放入15 ml離心管中保存，帶回實驗室分離培養。采用TSA培養基，在LRH250F生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）中28 ℃條件下培養。通過對分離培養的單菌落進行擴大培養后，采用分子生物學的方法，對其16sRNA片段進行擴增并測序，然后通過序列比對NCBI上的Blast功能進行鑒定。

1.2.2試驗處理。

設3個處理：①菌劑中什么都不加（CK），②菌劑中加入抗生素，③菌根中加入細菌。

由于塊菌子囊果內包含有很多的土著細菌，所以在實驗過程中，在向待接種的塊菌菌劑中加入抗生素。研究表明，氯霉素-鈉的濃度在160萬單位時，印度塊菌、夏塊菌和黑孢塊菌菌劑中的細菌能被有效抑制。

菌根接種時，向印度塊菌、夏塊菌菌劑中分別加入B1、B2、B3、B4、B5和B6。由于黑孢塊菌數量有限，僅將B1和B12這2種細菌用于Tm × Cm組合中。所有接種時加入的細菌菌液均為培養48 h的菌液。供試菌根苗加入的細菌菌液均為12 ml/株。

1.2.3菌根合成方法。

將滅菌處理的基質調解至所需pH水平，根據每株苗需要的接種濃度為5×106個孢子，需要的細菌量為培養48 h的菌液12 ml，向基質分別加入塊菌菌劑和細菌菌液，充分混勻，將剪過的幼苗移栽至裝有該基質的容器內。5種菌根組合的每個處理均接種20棵菌根苗，則Ti × Cm、Ti × Qf、Ta × Cm和Ta × Qf組合各接種160株，Tm × Cm接種80株，總計接種菌根苗720株。

1.3數據處理

每個處理各取15個樣本，對菌根苗的菌根進行計數，并且測量株高和地徑。進一步對不同處理之間數據的差異進行ANOVA分析，其中a*b的P值<0.05，b*c的P值<0.05，a*c的P值<0.01。

42卷36期鄧曉娟等塊菌菌根促棲菌研究

2.4不同處理對菌根數量的影響

不同處理對菌根苗的菌根數量、株高和地徑有抑制作用（-）、促進作用（+）或無影響（0）。由表1可知，在菌劑中加入抗生素后，對5個菌根組合形成的菌根數量均有顯著或極顯著的抑制作用。加入細菌B1后，對Ti × Qf 的菌根數量有極顯著的促進作用，但也極顯著地抑制了Ti × Cm的菌根數量，顯著地抑制了Ta × Cm和Ta × Qf的菌根數量，對Tm × Cm的菌根數量有促進作用，但這種促進作用在統計學上無意義。在加入細菌B2后，極顯著地抑制了Ti × Cm的菌根數量，對Ta × Qf的菌根數量有抑制作用，但這種抑制作用在統計學上無意義，對Ti × Qf 和Ta × Cm的菌根數量沒有影響。加入細菌B3后，極顯著地抑制了Ti × Cm的菌根數量，對Ta × Cm的菌根數量有抑制作用，但這種抑制作用在統計學上無意義，對Ti × Qf 和Ta × Qf 的菌根數量沒有影響。加入細菌B4后，顯著地抑制了Ti × Cm和Ta × Qf的菌根數量，對Ta × Cm的菌根數量有抑制作用，但這種抑制作用在統計學上無意義，對Ti × Qf的菌根數量沒有影響。加入細菌B5后，極顯著地抑制了Ti × Cm的菌根數量，顯著地抑制了Ta × Qf的菌根數量，對Ti × Qf的菌根數量有促進作用，對Ta × Cm的菌根數量有抑制作用，但都沒有統計學意義。加入細菌B12后，極顯著地抑制了Ti × Cm、Ta × Cm和Ta × Qf的菌根數量，極顯著地促進了Tm × Cm的菌根數量，對Ti × Qf的菌根數量沒有影響。

在塊菌菌劑中加入抗生素后，抑制了菌劑本身所帶細菌的生長，對5個不同菌根組合形成菌根的數量都具有顯著或極顯著地抑制作用，進而說明塊菌子囊果內土著細菌對于菌根的形成有顯著的促進作用。

菌根促棲菌的重要特征就是具有真菌特異性。MHBs經常會促進某些菌根組合的形成，但會抑制另外一些真菌形成菌根[6]。B1對于Ti + Qf菌根形成有極顯著促進作用，但對于Ti + Cm、Ta + Cm和Ta + Qf有顯著或極顯著地抑制作用。B12對Tm + Cm菌根形成有極顯著促進作用，但對于Ti + Cm、Ta + Cm和Ta + Qf有極顯著地抑制作用。

2.5不同處理對株高的影響

由表2可知，在菌劑中加入抗生素后，極顯著地抑制了Ta × Cm和Ta × Qf菌根苗的株高，抑制了Tm × Cm的株高，促進了Ti × Qf的株高，但都不具有統計學上的意義，對Ti × Cm的株高沒有影響。加入細菌B1后，顯著地抑制了Ta × Cm的株高，抑制了Ti × Cm和Ta × Qf的株高，但不具有統計學上的意義，對Ti × Qf和Ta × Qf的株高沒有影響。加入細菌B2后，極顯著地促進了Ti × Cm的株高，對Ti × Qf的株高有促進作用，對Ta × Cm有抑制作用，但都不具有統計學上的意義，對Ta × Qf的株高沒有影響。加入細菌B3后，極顯著地促進了Ti × Qf的株高，對Ti × Cm和Ta × Qf的株高有促進作用，對Ta × Cm的株高有抑制作用，但都不具有統計學上的意義。加入細菌B4后，極顯著地促進了Ti × Qf的株高，對Ti × Cm的株高有促進作用，但不具有統計學上的意義，對Ta × Cm和Ta × Qf的株高沒有影響。加入細菌B5后，對Ta × Qf的株高有促進作用，但不具有統計學意義，對Ti × Cm、Ti ×Qf和Ta × Cm都沒有影響。加入細菌B12后，極顯著地抑制了Ta × Qf的株高，極顯著地促進了Ti × Qf的株高，對Ti × Cm和Tm × Cm有促進作用，對Ta × Cm有抑制作用，但都不具有統計學上的意義。

由表2可知，在塊菌菌劑中加入抗生素（Anti）后，抑制了菌劑本身所帶細菌的生長，對形成的菌根苗的株高的影響表現不一致，其中對于Ta + Qf和Ta + Cm組合的株高有極顯著的抑制作用。子囊果內土著細菌對于不同組合的塊菌菌根苗的株高影響表現不一致。

細菌對于菌根苗的株高的影響也具有真菌特異性，B12極顯著地促進了Ti + Qf的株高，但同時極顯著地抑制了Ta + Qf的株高。

2.6不同處理對地徑的影響

由表3可知，在菌劑中加入抗生素后，極顯著地抑制了Ta × Cm菌根苗的地徑，抑制了Ta × Qf的地徑，促進了Tm × Cm的地徑，但都不具有統計學上的意義，對Ti × Cm和Ti × Qf的地徑沒有影響。加入細菌B1后，極顯著地抑制了Ti × Cm的地徑，極顯著地促進了Ti× Qf的地徑，抑制了Ta × Cm和Ta × Qf的地徑，促進了Tm × Cm的地徑，但都不具有統計學上的意義。加入細菌B2后，促進了Ti × Cm和Ti × Qf的地徑，但都不具有統計學上的意義，對Ta × Cm和Ta × Qf的地徑沒有影響。加入細菌B3后，極顯著地促進了Ti × Qf的地徑，對Ti × Cm、Ta × Cm和Ta × Qf的地徑沒有影響。加入細菌B4后，極顯著地促進了Ti × Qf的地徑，對Ta × Cm和Ta × Qf的地徑有促進作用，但都不具有統計學上的意義，對Ti × Cm的地徑沒有影響。加入細菌B5后，顯著地促進了Ti × Qf的地徑，對Ti × Cm和Ta × Qf的地徑有抑制作用，對Ta × Cm的地徑有促進作用，但都不具有統計學上的意義。加入細菌B12后，極顯著地促進了Ti × Qf的地徑，極顯著地抑制了Ta × Qf的地徑，對Ti × Cm和Ta × Cm有抑制作用，對Tm × Cm有促進作用，但都不具有統計學上的意義。

在塊菌菌劑中加入抗生素（Anti）后，抑制了菌劑本身所帶細菌的生長，對形成的菌根苗的地徑的影響表現不一致，其中對于Ta + Cm組合的地徑有極顯著的抑制作用。子囊果內土著細菌對于不同組合的塊菌菌根苗株高的影響表現不一致。

3結論

（1）細菌對于不同的菌根組合形成的菌根數量具有真菌特異性。它會促進某些菌根組合的形成，但會抑制另外一些真菌形成菌根。塊菌子囊果內土著細菌對于菌根的形成有顯著促進作用。

（2）細菌對于不同組合的菌根苗株高也具有真菌特異性。它會促進某些組合的菌根苗株高，但會抑制另外一些組合的菌根苗株高。塊菌子囊果內土著細菌對于不同組合菌根苗株高的影響不一致。

（3）細菌對于不同組合的菌根苗地徑也具有真菌特異性。它會促進某些組合的菌根苗地徑，但會抑制另外一些組合的菌根苗地徑。塊菌子囊果內土著細菌對于不同組合菌根苗地徑的影響不一致。

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