橡子淀粉乙醇化酵母菌種的篩選

欒泰龍等

摘要

[目的] 篩選適于以橡子淀粉為發酵原料的高性能優良酵母菌種。 [方法]從幾種工業上較常用的酒精用酵母中，篩選適合于橡子淀粉質原料發酵的菌種，對它們的發酵性能、酒精產量、殘糖含量等方面進行分析比較。[結果]分析得出，南陽6號酵母較其他菌株的酒精產率高、殘還原糖低，發酵性能優良；而蘭州L166發酵性能較高，同時耐受性好，南陽6號與蘭州L166是所選取的菌株中較適合橡子淀粉發酵生產燃料乙醇的菌株。[結論]在實際生產過程中，應根據橡子原料中成分的不同對相應菌種加以選用。

關鍵詞橡子；發酵；釀酒酵母；篩選

中圖分類號S188+.4文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）36-13028-03

Abstract[Objective] To screen out high performance excellent yeast strains with acorn starch as fermentation raw material. [Method] The appropriate strains were selected from several commonly used yeasts in industry， the fermentation performance， alcohol yield and the content of residual sugar were compared. [Result] Compared with other strains， yeast of Nanyang No.6 has higher alcohol yield， lower residual reducing sugar， and excellent fermentation performance； Lanzhou L166 has higher fermentation performance and good tolerance， Nanyang No.6 and Lanzhou L166 are appropriate strains for producing ethanol by acorn starch fermentation. [Conclusion] In practical production process， appropriate strains should be selected according to composition of acorn raw material.

Key words Acorn； Fermentation； Yeast for ethanol production； Screening

燃料乙醇屬于可再生能源，是一種綠色、清潔的能源。燃料乙醇的抗爆性能良好，將其用作車用燃料能夠使燃燒更加充分， 大大降低汽車尾氣排放量， 降低對環境的污染。燃料乙醇作為替代石油能源的綠色可再生能源日益受到人們的關注。大量使用燃料乙醇除了對環境的保護益處明顯外，還降低了國家對進口石油的依賴程度、降低能源支出在社會消費中所占的比例等，使用燃料乙醇意義重大[1-2]。

我國櫟類資源豐富、分布區域廣泛，橡子種仁中淀粉含量高，是代替糧食作物制備生產燃料乙醇的理想來源[3]。燃料乙醇的生產目前主要采用發酵法，發酵時淀粉水解為可發酵性糖，進而被微生物轉化為乙醇和二氧化碳，在這個過程中菌株發酵性能的高低就成為了影響淀粉利用率和酒精產量的關鍵因素。以橡子淀粉為發酵原料的菌種應具有酒精產量高、淀粉利用率好、適應性強、抗性好等特點[4]。篩選以橡子淀粉為發酵原料的優良酵母菌種，不僅可以提高酒精發酵質量和淀粉出酒率，而且能降低原料消耗及生產成本。筆者選取幾種工業上較常用的酒精用酵母，從發酵菌株的發酵性能、酒精產量、殘糖含量及耐性等方面進行試驗，以期得到適于橡子發酵的高性能酵母菌種。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1

供試菌種。黃海109、蘭州L166、天津R12、濟南Rasse12、南陽5號、6號，分別編號為XZ01～XZ06，以上酵母菌種由黑龍江省微生物研究所提供。

1.1.2

主要試劑。葡萄糖、酵母膏、氯化銨、硫酸鎂、蛋白胨、磷酸二氫鉀、3，5二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉，苯酚、亞硫酸鈉、鹽酸、無水乙醇等，均為分析純。

1.1.3

主要儀器。XFS280A手提式壓力蒸汽滅菌器，浙江新豐醫療器械有限公司；HWS28電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；722N可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；HPX9272 MBE數顯不銹鋼電熱培養箱，上海博訊實業有限公司；RE 5286A旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠。

1.1.4

培養基。YPD培養基：蛋白胨 2%，酵母膏1%，葡萄糖2%，pH 6.0（固體培養基加瓊脂1.5%～2.0%），115 ℃滅菌15 min。發酵培養基：葡萄糖15.0 g，酵母浸膏0.5 g，NH4Cl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.06 g，蛋白胨0.5 g，KH2PO4 0.1 g， 用蒸餾水定容至100 ml，培養基pH用H2SO4調節至4.5，121 ℃溫度下滅菌20 min。

1.2試驗方法

試驗選取南陽6號等6種酒精用酵母為發酵菌株，通過對發酵菌株的產酒精能力、產氣量、殘糖含量等方面的進行比較，以得到適合于橡子淀粉發酵的高性能酵母菌種。

1.2.1

酵母產氣性能試驗。將待試的不同酵母菌株活化好后接種至250 ml三角瓶中，接種量2%，將三角瓶置于28 ℃條件下恒溫發酵至結束。CO2失重的測定：采用直接稱重法，每經過24 h將三角瓶稱重1次直至發酵自然停止，計算接種發酵后在單位時間內CO2的釋放量。

1.2.2

產酒精能力的測定[5]。酒精含量的測定：采用比重計法。發酵結束后取100 ml發酵醪液置于500 ml蒸餾瓶內，并加100 ml蒸餾水，加熱蒸餾直至餾出 100 ml溶液，用酒精比重計測定餾出液中的酒精度，同時測定餾出液的溫度，并換算為20 ℃時的酒精濃度。

1.2.3

殘糖含量的測定[6]。發酵結束后取5 ml醪液過濾，將濾液稀釋至100 ml容量瓶，用DNS法測定。

1.2.4

酵母耐性試驗。將酵母分別接入含不同乙醇濃度（0%vol、3%vol、6%vol、9%vol、12%vol）、葡萄糖濃度（100、200、300、400、500 g/L）、單寧濃度（1%、2%、3%、4%、5%）的發酵培養基中，28 ℃條件下恒溫發酵，分別測量發酵后的OD560值。

2結果與分析

2.1 酵母發酵性能結果

在發酵過程中，釀酒酵母經過不斷利用底物原料產生酒精，并釋放出CO2，發酵液重量隨之減少。但是各酵母菌株的代謝能力有一定差異，對底物原料的利用程度不同，導致最終產氣量存在差別。

通過測定發酵后幾株酵母的產氣量，并將其記錄下來，以CO2產生量為縱坐標，發酵時間為橫坐標，繪制CO2產生量曲線，結果見圖1。由圖1可以看出，在接種24 h內幾種菌株都能快速地開始發酵，并且以菌株XZ02產氣量較多，隨著發酵過程的進行，各菌株的產氣量均有增加，尤其以24～72 h內產氣量增幅最大，而在發酵72 h后CO2產生量逐漸下降。發酵終止時，累計發酵產氣量以菌株XZ02略高，而其他幾個酵母菌株與其相比，產氣量依次降低。

2.2酒精產量及殘糖含量的測定結果

各菌株接入培養基后經過發酵，試驗結果顯示，XZ06在發酵結束后產酒精量最多，為14.2%vol，XZ04其次。對發酵液中的酒精含量進行單因素方差分析，發現各菌株發酵后XZ06、XZ04的酒精含量顯著高于其他4種酵母菌（P<0.05），產酒精能力較強。

殘還原糖含量低，表明發酵液中原料利用充分。通過試驗結果可以看出，發酵后菌株XZ03的殘糖含量最低，為7.12 g/L，XZ06其次。對發酵后的殘糖含量進行單因素方差分析發現，發酵后XZ03、XZ06的殘糖含量顯著低于其他4種酵母菌（P<0.05），表明這2個菌株利用糖類的能力較強，能使發酵進行的比較徹底。

2.3酵母耐性試驗結果

2.3.1

乙醇耐性試驗。

將活化好的酵母菌分別接入不同酒精濃度的發酵培養基中發酵，截取發酵48 h時的酵母生長情況，比較它們在不同酒精濃度條件下的生長情況，其結果見圖3。

從圖3中可以看出，在初始發酵液中酒精濃度為0%vol～6%vol的條件下，發酵48 h后幾種酵母的吸光度值逐漸下降，其中以XZ05、XZ06下降速率較快，XZ01、XZ02 2個菌株下降較平穩。當在初始發酵液中酒精濃度達到6%vol～12%vol的條件時，經過48 h發酵，6種菌株的吸光度值下降均較快，說明在較高酒精濃度條件下，各菌種的酒精耐受能力下降較大，但最終以XZ01、XZ02的吸光度值略高。從各種酵母菌株的酒精耐受比較結果可以看出，XZ01、XZ02比其他酵母菌株具有更強的耐受酒精能力。

2.3.2

糖濃度耐性試驗。

將活化好的酵母菌分別接入不同葡萄糖濃度的發酵培養基中發酵，測定發酵培養基經24 h發酵后的吸光度值，比較各菌株在不同葡萄糖濃度條件下菌體的生長情況。通過圖4顯示出，當發酵液中糖濃度在100～200 g/L時，經過一段時間的發酵培養，各酵母菌株發酵液的吸光度均較大。隨后隨著糖濃度的增大，各菌株的吸光度均減小，說明發酵液中的糖濃度含量在100～200 g/L時更適合這幾種酵母菌株的生長。當糖濃度升高到500 g/L時，各酵母生長都趨于緩慢，同時XZ01～XZ04吸光度接近，但高于XZ05、XZ06。

發酵結果表明，當發酵液中糖濃度較低時，幾種菌株發酵狀況良好，當發酵液中糖濃度較高時，XZ05、XZ06的糖耐受性低于其他菌株。初始的發酵糖濃度對酵母菌生長存在一定的影響，因此，在以橡子淀粉為發酵原料的培養基中應根據淀粉水解程度選擇適合于發酵的酵母菌。

2.3.3

單寧濃度試驗。

各酵母菌種在含不同濃度單寧的培養基中經過24 h發酵，其結果如圖5。從圖5中可以看出，發酵過程隨單寧濃度的升高整體呈下降趨勢。XZ01、XZ03 2個菌株在各個濃度下均生長緩慢，XZ04在1%～2%單寧濃度范圍內吸光度值下降較快，表示這3個菌株在低單寧濃度時即受到較大抑制，其他3個菌株在各濃度條件下吸光度值下降均勻，其中XZ02的吸光度值相對較高，在5%單寧濃度條件下XZ06吸光度最大，

3 結論

橡子中淀粉含量高，是潛在的重要淀粉質原料來源，以橡實淀粉為原料制備燃料乙醇具有良好的物質基礎。通過上述試驗結果，分別從酒精產率和菌株耐性等方面綜合考慮，南陽6號較其他菌株的酒精產率高、殘還原糖低，發酵性能優良；而蘭州L166發酵性能較高，同時耐受性好，南陽6號與蘭州L166是所選取的菌株中較適合橡子淀粉發酵生產燃料乙醇的菌株。在實際生產過程中，應根據橡子原料中成分的不同對相應菌種加以選用。

參考文獻

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