葡萄品系間果實花色苷的比較研究

韓梅梅　楊曉帆　王軍　潘秋紅

摘 要 利用高效液相色譜-質譜技術，分析3個釀酒葡萄品種（美樂、品麗珠、赤霞珠）不同品系及同一品系（赤霞珠338）不同定植地點葡萄果皮中的花色苷種類與含量。結果表明：同一品種不同品系之間花色苷種類相似，但花色苷含量有所差異，差異程度取決于葡萄品種；‘美樂348總花色苷含量顯著高于‘美樂181，且其花翠素類花色苷含量明顯高于其他3個品系，品系間大部分花色苷含量差異顯著；盡管‘品麗珠和‘赤霞珠各品系在花色苷總量和花翠素類花色苷上沒有明顯差異，但這2個品種的品系之間有少數基本花色苷含量呈現顯著性差異；同一品系不同定植地點，果實花色苷總量和組成比例都存在較大差異。結果說明果實中各種花色苷組成比例既依賴于品種，也受品系和產地的影響，且產地因素的影響大于品系。

關鍵詞 花色苷；品系；定植地點；釀酒葡萄

中圖分類號 Q946.83+6 文獻標識碼 A

花色苷是紅色葡萄品種及紅葡萄酒的主要呈色物質，其種類與含量決定了葡萄與葡萄酒的呈色[1]。葡萄酒中的花色苷主要來源于葡萄果實，在葡萄酒陳釀過程中，花色苷還可以與單寧等其它物質作用，進而影響葡萄酒的色澤與口感[2-3]。此外，花色苷具有抗氧化和清除自由基的生理活性[4-5]，是葡萄酒保健功效的貢獻者之一。因此，葡萄果實中的花色苷對葡萄酒的顏色、口感、營養價值等多方面有作用。

葡萄果實花色苷的生物合成有2個分支：一個是類黃酮-3′-羥基化酶（F3′H）介導的花青素類花色苷的合成途徑，另一個是類黃酮-3′5′-羥基化酶（F3′5′H）介導的花翠素類花色苷的合成途徑[6]（圖1）。這2類花色苷主要差異在于B環取代基數目的不同，花青素類是3′和4′取代，而花翠素類為3′、4′和5′取代，其最大吸收波長分別為516～525 nm，二者可分別使葡萄果皮呈現紫紅色和紫羅蘭色/藍色色調[7]。B-環上取代基數目越多，花色苷越偏向于藍色色調[8]。因此，花色苷種類與含量在很大程度上決定了葡萄酒的色澤，進而影響葡萄酒的感官質量。

歐亞種（Vitis Vinifera L.）釀酒葡萄總花色苷中B-環3′5′-位取代花色苷所占比例遠高于B-環3′-位取代的花色苷，并且主要以甲基形式取代[9]。中國主要紅色釀酒品種有赤霞珠、品麗珠、蛇龍珠及美樂等歐亞種，果實花色苷種類與含量不僅取決于自身基因型，而且受如溫度、光照、水分和土壤養分等環境條件強烈影響[10-15]，使得同一品種在不同地區展現出不同花色苷指紋。關于葡萄果實花色苷的研究，以往的報道主要集中于不同葡萄品種之間的比較，環境條件及生長調節劑對花色苷積累的影響以及花色苷生物合成與調控[6，13，16-18]，而對同一品種不同品系之間的花色苷關注較少。

品系是指品種內的不同類型，或在育種過程中，表現較好，但還沒有成為品種之前的變異類型[19]。同一葡萄品種不同品系之間花色苷指紋有何差異？品系之間的差異在不同品種之間是否有共性？在不同定植地點同一品系花色苷指紋又有何不同？本研究采用高效液相色譜-質譜（HPLC-MS）技術分析了3個常見釀酒葡萄品種美樂、品麗珠和赤霞珠的不同品系中花色苷的種類及含量，找出其異同點，為新品系的推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 品系 參試材料為美樂（Vitis vinifera L. Merlot）4個品系181、343、346和348；品麗珠（Vitis vinifera L. Cabernet Franc）2個品系327和409；赤霞珠（Vitis vinifera L. Cabernet Sauvignon）3個品系170、338和685；這些品系均在2006年定植于河北昌黎華夏長城葡萄酒公司華夏母本園，參照上一年葡萄商業采收期，結合當年的氣候狀態，分別于2009年9月21日、10月5日和10月14日取樣，為使取樣具有代表性，按Boulton等[20]所述方法摘取百粒果，采后存放于泡沫盒內，于當天運回實驗室。

1.1.2 栽培環境條件 不同定植地點葡萄花色苷差異的研究所用樣品為‘赤霞珠338，取樣地點分別為華夏長城葡萄酒公司位于河北省撫寧縣吳官營村葡萄園的4個地塊，分別以‘低洼、‘高坡、‘門前、‘屋后代稱。吳官營村北靠森林，東西相接英山河水庫，3面群山環抱，坡度較高，北坡向陽，日照充足，晝夜溫差大，無霜期195 d左右，年降雨量550 mm；葡萄園為南北行向，行株距為2.5 m×0.6 m。本研究中‘低洼與‘高坡地塊主要是坡度的差異，‘門前地塊為向陽面，光照充足，‘屋后為陰面，其它栽培條件一致，即不同地塊主要是坡向不同，導致葡萄園持水與受光存在較大差異。所有樣品均達到商業采收期，且成熟度較一致。采樣方法同上。

1.2 方法

1.2.1 葡萄果皮中花色苷的提取 將葡萄樣品果皮剝離并用液氮研磨，冷凍干燥，干燥后的粉末于-40 ℃冰箱中保存備用。（1）稱取葡萄皮干粉0.5 g置于三角瓶中；（2）加入10 mL含2%甲酸甲醇提取液，超聲萃取10 min，于25 ℃下避光以150 r/min震蕩萃取30 min，然后以8 000 ×g離心10 min，轉移上清液于100 mL圓底燒瓶中，重復提取5次；（3）合并上清液，經30 ℃真空旋轉蒸發除去甲酸和甲醇，用定容劑（流動相A ∶ B=9 ∶ 1）重新溶解并定容至10 mL，以0.22 μm水系膜過濾上樣。

1.2.2 HPLC-ESI-MS分析 采用Agilent 1100系列配有二極管陣列檢測器（DAD）的LC/MSD Trap-VL液相色譜-離子阱-質譜聯用儀（美國安捷倫公司）進行樣品分析，MSD包括電噴霧離子源和離子阱質譜檢測器，所有部件均由安捷倫v.5.2化學工作站控制。色譜柱：Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm）；流動相A ∶ 水 ∶ 甲酸 ∶ 乙腈=92 ∶ 2 ∶ 6（V ∶ V ∶ V），流動相B ∶ 水 ∶ 甲酸 ∶ 乙腈=44 ∶ 2 ∶ 54（V ∶ V ∶ V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：50 ℃；進樣量：30 μL；檢測波長：525 nm。

1.2.3 花色苷定性定量方法 （1）定性分析：基于本實驗室建立的“葡萄與葡萄酒花色苷 HPLC-UV-MS/MS指紋譜庫”的基礎上，通過對樣品HPLC-UV-MS/MS圖譜中質譜信息、光譜信息和保留時間與譜庫比對分析，確定花色苷組分。

（2）定量分析：以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷為標準物，建立5～500 mg/L之間9個水平、3個重復的標準曲線，線性回歸系數在0.999以上，進行外標法定量，所有花色苷均以相當于二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量計。果皮中花色苷含量均用mg/g（每克干果皮中所含花色苷的毫克數）表示。

1.3 數據統計分析

每個葡萄樣品均進行3個獨立的提取，以獲得3個重復，以獨立方差T檢驗進行兩兩差異顯著性分析，使用鄧肯式多重比較進行3個以上樣品差異顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 不同品系葡萄果皮花色苷總量的比較

從圖2可看出，對于不同葡萄品種，品系間花色苷含量組成不同?！罉?48果皮中總花色苷含量顯著高于‘美樂181，這主要是由于該品系含有很高的花翠素類花色苷。而‘美樂343和‘美樂346與‘美樂348相比，在總花色苷含量上沒有顯著性差異，但花青素類花色苷含量明顯較高。這些結果說明在‘美樂348果皮花色苷合成途徑中，碳源更多地流向F3′5′H支路而生成花翠素類花色苷；‘美樂181果皮中的花色苷類物質含量在4個品系中最低。

‘品麗珠327和‘品麗珠409果皮中的總花色苷、花翠素類花色苷及花青素類花色苷含量均沒有顯著性差異。對于‘赤霞珠的3個品系，總花色苷和花翠素類花色苷含量沒有統計學上的顯著性差異，但‘赤霞珠338花青素類花色苷含量高于‘赤霞珠170和‘赤霞珠685。

此外還可以看出，‘品麗珠與‘赤霞珠果皮中各類花色苷的含量比例相似，花青素類花色苷占總花色苷的10%左右。除了‘美樂348中花青素類花色苷占總花色苷的17%以外，美樂其它品系花青素類花色苷所占比例達到20%以上，且除‘美樂181以外，‘美樂其它品系的花色苷總量高于‘品麗珠與‘赤霞珠。

2.2 不同品系葡萄果皮各種花色苷含量的比較

品系之間花色苷種類差別不大。從表1～3可以看出，除‘赤霞珠338沒有檢測到甲基花翠素-3-O-6-反式香豆?；咸烟擒蘸投谆ù渌?3-O-6-反式香豆酰化葡萄糖苷以外，其它所有樣品均檢測到16種花色苷。

在‘美樂4個品系中，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷含量最高，占花色苷總量的20%以上。其次含量較高的依次是甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-6-乙?；咸烟擒占岸谆ù渌?3-O-6-反式香豆?；咸烟擒铡Ｔ凇罉?48果皮中后兩者含量顯著高于甲基花青素-3-O-葡萄糖苷，并且顯著高于其它3個品系；‘美樂343和‘美樂346果皮中的甲基花青素-3-O-葡萄糖苷含量顯著高于‘美樂181與‘美樂348。這4種花色苷占 ‘美樂總花色苷含量的一半以上，是‘美樂葡萄的主要花色苷。‘美樂348葡萄果皮中的4種主要花色苷含量之和顯著高于另外3個品系。除了甲基花翠素-3-O-6-順式香豆?；咸烟擒罩?，其它15種花色苷的含量在品系之間或多或少都存在差異（表1）。

就‘品麗珠而言，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷占花色苷總量的30%以上，其次是二甲花翠素-3-O-6-乙酰化葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-6-反式香豆?；咸烟擒占凹谆ㄇ嗨?3-O-葡萄糖苷。‘品麗珠327中除了甲基花青素-3-O-葡萄糖苷和花翠素-3-O-葡萄糖苷含量顯著高于‘品麗珠409以外，其他花色苷物質在2品系之間均沒有顯著性差異。另外，4種主要花色苷占 ‘品麗珠總花色苷含量的70%以上，其含量之和在‘品麗珠327與‘品麗珠409之間也沒有顯著性差異（表2）

與‘美樂和‘品麗珠相似，‘赤霞珠果皮中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷含量最高，占總花色苷含量的40%以上，其次為二甲花翠素-3-O-6-乙酰化葡萄糖苷、花翠素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-6-反式香豆?；咸烟擒?；除‘赤霞珠338中甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-6-乙?；咸烟擒蘸突ù渌?3-O-6-香豆?；咸烟擒蘸匡@著高于‘赤霞珠170和‘赤霞珠685以外，其它花色苷在‘赤霞珠3個品系間均無顯著性差異（表3）。

以上結果表明，‘美樂各品系之間大部分花色苷存在顯著性差異，而‘品麗珠和‘赤霞珠中，各品系之間只有2～4種主要花色苷存在統計學的顯著性差異，其它大部分花色苷差異不明顯，說明葡萄果實花色苷含量既依賴于品種也依賴于品系，品系的影響相對要小得多。

2.3 不同定植地點‘赤霞珠338果皮花色苷含量的比較

各地塊種植的‘赤霞珠338在花色苷組成比例上也存在一定差異（圖3），4個地塊中，‘屋后地塊‘赤霞珠338中的總花色苷含量最高，表現為花翠素類和花青素類花色苷含量均很高，且均顯著高于‘低洼地塊樣品，在總量上與其它2地塊沒有顯著性差異。

所有地塊樣品均檢測到16種花色苷（表4），‘屋后地塊葡萄果皮中，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-6-乙?；咸烟擒?、花翠素-3-O-葡萄糖苷和甲基花青素-3-O-葡萄糖苷等4種花色苷的含量顯著高于‘低洼地塊，這4種花色苷含量占了總量的70%。其它種類的花色苷在不同地塊之間也存在差異。與品系因素的影響相比，葡萄種植環境對花色苷組成比例的影響相對較大。

3 討論與結論

本研究表明，葡萄品系之間花色苷含量存在差異，其差異程度取決于葡萄品種?！符愔楹汀嘞贾楦髌废抵g只有少數基本花色苷存在顯著性差異，而‘美樂各品系之間大部分的花色苷存在明顯差異。這與何建軍[7]研究結果一致，其報道指出歐亞種葡萄中‘美樂品種的F3′H途徑較為活躍；而‘美樂品系間花色苷含量的差異主要與類黃酮途徑中碳源更多地流向F3′5′H分支途徑有關。

不同定植地的土壤及微氣候對果皮花色苷含量的影響可能更大。對于同一品系，不同地塊生長的果實中各種花色苷的含量存在較大差異。本研究表明這種差異主要在于整個類黃酮代謝的強弱，類黃酮代謝中2個分支路徑的影響程度相似。有研究顯示，灌溉過量會使花色苷濃度降低，而水分缺失則導致花色苷含量升高[13，15，21]；低溫可以促進花色苷的合成，光照過強對花色苷有抑制作用[10-11，22-23]。本研究中‘屋后地的果實，其花色苷合成的2個分支途徑的產物均顯著高于‘低洼地生長的果實，這是由于‘屋后地塊溫度較低，‘低洼地塊光照過強且易積累水分等因素造成的。

葡萄果實中花色苷的合成會受到基因型和環境因素等多方面的影響[24]。不同品種或品系的葡萄，由于其基因型的差異會影響花色苷物質的含量和種類；而不同定植地點的同一葡萄品種或品系，由于光照、溫度、水分條件等差異也會導致花色苷含量有所差異。因此，針對不同的品種、品系特點，合理選擇定植區域，才能發揮其優勢。

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