蜀本草多糖的提取及抑菌活性研究

孫茜等

摘要[目的]研究蜀本草多糖的優(yōu)化提取工藝和抑菌活性。[方法]通過提取溫度、提取時間、料液比等單因素和正交試驗對勻漿熱水提法提取蜀本草多糖工藝進行了優(yōu)化，同時利用所得多糖進行體外抑菌活性試驗和熱穩(wěn)定性研究。[結果]蜀本草多糖提取最優(yōu)條件為提取溫度65 ℃、料液比（m/v）1∶45、提取時間75 min，多糖得率最高為6.28%；抑菌活性試驗結果表明，蜀本草多糖提取物對酵母菌無明顯抑制作用，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用；蜀本草粗多糖提取物在100 ℃及以下活性穩(wěn)定。[結論]該研究為開發(fā)利用蜀本草多糖提供理論依據(jù)。

關鍵詞蜀本草；多糖；正交試驗；抑菌活性；熱穩(wěn)定性

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）36-12909-03

Abstract[Objective]The research aimed to study the extraction technology and the bacteriostatic activity of Portulaca oleracea L..[Method]The homogenate and hot water extraction method was used to gain the optimization extract condition of polysaccharides from Portulaca oleracea L. by orthogonal experiment.The purified polysaccharide was investigated about antibacterial activity and heat stability.[Result]The orthogonal experiment shows that the large yield of polysaccharide was 6.28% at 65 ℃， solventsolid ratio 1∶45，75 min. Antibacterial activity of the experiment shows that the polysaccharide had no significant inhibitory effect on saccharomycete，and it had obvious inhibitory effect on three bacteria （Escherichia coli， Staphylococcus aureus， Sacillus subtilis）. The bacteriostatic stability of polysaccharide was active under 100 ℃.[Conclusion]The study provides the theoretical basis for the development and utilization of Portulaca oleracea L. polysaccharide.

Key wordsPortulaca oleracea L.； Polysaccharide； Orthogonal experiment； Antibacterial activity； Heat stability

蜀本草（Portulaca oleracea L.）為蜀本草科蜀本草屬植物，屬于藥食同源的野生植物之一，不僅具有很高的營養(yǎng)價值，且具有清熱解毒、利水去濕、散血消腫、除塵殺菌、消炎止痛、止血涼血等多種藥理功能[1]。蜀本草含有豐富的植物多糖，而植物多糖在自然界中作為一種重要的天然活性物質(zhì)，其最大的優(yōu)點在于毒副作用小、資源來源廣泛、成本低廉，且在高溫下植物多糖的性質(zhì)很穩(wěn)定。因此，植物多糖被廣泛應用于高效低毒藥物和功能食品的研發(fā)中。研究表明，多糖的提取方法主要有水提法、酶提法、超聲波法等[2]。該試驗以勻漿+熱水提法提取蜀本草多糖，并通過正交試驗對該法進行了條件優(yōu)化，最后對蜀本草多糖體外抑菌活性和熱穩(wěn)定性進行了初步探究，為合理有效開發(fā)利用蜀本草多糖提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料和試劑

蜀本草于2013年9月采自武漢東湖學院大棚試驗基地。采摘后洗凈，40 ℃烘干至恒重，粉碎后過40目篩，密封備用。抑菌試驗所用的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌等均由武漢大學生科院提供，分別于對應的培養(yǎng)基中接種活化后備用。

LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、水飽和酚、無水乙醇、葡萄糖等試劑均為分析純。

1.2儀器

WFJ 7200型可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；MIKRO 22R臺式冷凍離心機，德國赫提馳公司；gentle MACS Dissociator，德國美天旎生物技術有限公司；MJ300BSⅡ霉菌培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；CHAS恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3方法

1.3.1蜀本草多糖提取的單因素和正交試驗。

稱取蜀本草粉碎樣品5份，以不同的提取溫度、不同的料液比、不同的提取時間采用單因素和正交試驗提取多糖，過濾脫色定溶，用苯酚硫酸法[3]測定多糖含量，確定馬齒莧多糖的提取工藝。

1.3.2蜀本草多糖抑菌試驗。

1.3.2.1蜀本草多糖的制備。

采用正交試驗最佳工藝條件處理蜀本草，提取液經(jīng)過濾、濃縮、脫色、去蛋白、乙醇沉淀等處理后得粗多糖[4]，冷凍干燥備用。稱取干燥后蜀本草多糖5 g，加適量蒸餾水浸泡15 min，過濾濃縮溶液至10 ml，配制成0.5 g/ml多糖溶液，再用蒸餾水等倍稀釋制成0.25、0125 g/ml溶液，置于冰箱中待用。

1.3.2.2抑菌試驗。

通過平板打孔法測定蜀本草多糖對供試菌的抑制效果[3-4]。采用涂布法制成含菌平板。用打孔器在上述含菌平板上均勻打3個大小相同的孔，等量加入3種不同濃度蜀本草多糖溶液，每組3個平行，對照組均加無菌水。大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；酵母菌放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。測定抑菌圈直徑，取其平均值。

1.3.2.3最低抑菌濃度（MIC）的測定。

通過抑菌試驗結果制定最低抑菌濃度（MIC），采用濃度梯度傾注平板法測定目標菌的最小抑菌濃度（MIC），以平板中無菌落生長為判斷標準。

1.3.3熱穩(wěn)定性試驗。

由最小濃度抑制試驗確定每種菌的最低抑制濃度，將最低抑菌濃度下的蜀本草多糖溶液分別在80、100和121 ℃濕熱條件下處理15 min后做抑菌試驗[5-6]。

2結果與分析

2.1單因素條件下蜀本草多糖提取效果

2.1.1提取時間對蜀本草多糖得率的影響[5]。

稱取蜀本草5份，按料液比1∶40（m/v）分別加入蒸餾水，于40 ℃水浴預處理10 min，然后勻漿處理2 min，最后在80 ℃水浴下，分別處理60、70、80、90、100 min，提取液離心取上清，采用苯酚硫酸法[3]測量多糖含量并計算得率。結果發(fā)現(xiàn)（圖1），60～80 min多糖得率逐漸增高，80 min時，多糖得率最高，而后隨著時間的延長，多糖得率開始下降，說明提取時間過長對多糖分子有影響。

3結論

（1）蜀本草多糖的提取方法主要有熱水提法、酶提法、超聲輔助提法，試驗中發(fā)現(xiàn)蜀本草葉片經(jīng)過組織勻漿后再用熱水提效果較好，有可能成為替代超聲波輔助提法的又一工藝，并通過正交試驗對該工藝進行了條件優(yōu)化，找到了最佳工藝條件為提取溫度65 ℃、料液比（m/v）1∶45、提取時間75 min，多糖得率最高為6.28%。

（2）試驗中按照最優(yōu)條件提取的蜀本草多糖對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金花色葡萄球菌等3種試驗細菌有抑制作用，對酵母菌無作用。其中對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度范圍在0.100～0.120 g/ml，金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度范圍為0.080～0.100 g/ml。

（3）蜀本草多糖在100 ℃下具有抗菌活性，具備良好的熱穩(wěn)定性，具有良好的應用前景。

（4）素有“天然抗生素”之美稱的蜀本草，其具有廣譜的抗菌作用[10-11]，這一點對于在抗生素濫用的今天來說尤為重要。近年來，關于蜀本草多糖的研究屢見不鮮，諸多文獻對其化學結構和藥理作用的研究還處于初步階段，相關研究工作有待進一步深入。如能將多糖進行分離純化后，探究單一成分的作用，將體外與體內(nèi)試驗有機結合，并從宏觀到微觀層次上研究蜀本草多糖作用機制，則能更好地將相關理論應用于生產(chǎn)實踐。如今，保健食品市場不斷擴大，越來越多的人對其認知度和購買欲隨之提高，而活性多糖現(xiàn)已成為天然藥物學和保健食品學的研究熱點，尋找高效天然無毒副作用藥物是保健食品研究項目之一。

參考文獻

[1] 王玉生，蔡岳文.南方藥用植物圖鑒[M].汕頭：汕頭大學出版社，2004：60.

[2] 李海燕，王旭深.馬齒莧多糖提取方法的比較[J].第一軍醫(yī)大學分校學報，2005，28（2）：186-187.

[3] 陳鈞輝，李俊，張冬梅，等.生物化學實驗[M].4版.北京：科學出版社，2008：15-16.

[4] 曲曉蘭，蘇延友，高紅莉.馬齒莧不同采收期多糖含量的測定[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17（10）：1960-1961.

[5] 朱丹，牛廣財，孟憲軍.馬齒莧多糖提取工藝的研究[J].中國農(nóng)學通報，2006，22（8）：119-122.

[6] 曹光明.中藥浸提物生產(chǎn)工藝學[M].北京：化學工業(yè)出版社，2009：51-61.

[7] PALAILISWAMYA U R，BIBLE B B，MCAVOY R J.Oxalic acid concentraions in Purslane（Portulaca oleraceae L.）is altered by the stage of harvest and the nitrate to ammonium ratios in hydroponics[J].Journal of American Society for Horticultural Science，2004，102（2）：267-275.

[8] 屠鵬飛.天然糖化學[M].北京：化學工業(yè)出版社，2013：116-122.

[9] DING S，DUDLEY E，PLUMMER S，et al.Fingerprint profile of Ginkgo biloba nutritional supplements by LC/ESIMS/MS[J].Phytochem，2008，69（13/14）：1555-1564.

[10] 劉紹軍，周麗艷，趙希艷.馬齒莧提取物抑霉作用及其在番茄貯藏上的應用[J].食品科技，2006，31（2）：103-105.

[11] RADHAKRISHNAN R，ZAKARIA M N，ISLAM M W.Neuropharmacological actions of Portulaca oleraceae L v.sativa（Hawk）[J].Journal of Ethnopharmacology，2001，76（2）：171-176.