雙水相體系協同超聲提取法分離定心藤總黃酮

李維峰等

摘要[目的]以定心藤為原料，研究超聲耦合乙醇-硫酸銨雙水相體系提取定心藤總黃酮最佳工藝。[方法]通過單因素試驗和正交試驗對影響定心藤的料液比、硫酸銨濃度、乙醇濃度和超聲時間等因素進行探討。[結果]影響定心藤總黃酮提取因素的主次順序為乙醇濃度>超聲時間>硫酸銨濃度>料液比，最優提取條件為乙醇濃度80%、料液比1∶50、超聲時間30 min、硫酸銨質量濃度為0.30 g/ml，在此條件下，定心藤總黃酮得率為2.02%。[結論]該研究可為定心藤總黃酮提取工藝的設計提供一定的理論依據。

關鍵詞雙水相；定心藤；總黃酮；超聲耦合

中圖分類號S567；R284文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）36-12904-03

Abstract[Objective] With Mappianthus iodioides as raw material， the research aimed to study the flavonoids extraction process from Mappianthus iodioides by ultrasonicassisted alcoholammonium sulphate aqueous twophase system. [Method] To determine the optimal extraction conditions， the effect of the conditions， such as the ethanol concentration， the solidliquid ratio， the amount of the ammonium sulfate， the ultrasonic time， were studied by the single factor experiment and the orthogonal test. [Result] The results showed that the order of factor to affect total flavones extraction was ethanol concentration> ultrasonic time> ammonium sulfate concentration>material to extraction solution ration. The optimum extracting conditions were as follows： the volume fraction of alcohol 80%， solid to solution ratio of 1∶50， ultrasonic time 30 min， the ammonium sulfate 0.3 g/ml. At the optimum conditions， the extraction rate of the flavonoids could reach 2.02%. [Conclusion] The study provides the theoretical basis for the flavonoids extraction process of Mappianthus iodioides.

Key wordsAqueous twophase； Mappianthus iodioides； Total flavones； Ultrasonic coupling

傣族 “雅解”藥中定心藤稱為鄧嘿罕，是“雅解”藥多種單方或復方解藥的重要藥物之一，為茱萸科植物定心藤Mappianthus iodioides Hand.Mazz的干燥藤莖。據《傣藥學》記載，該藥性涼、味甜，具有清火定心、利膽退黃、通氣止痛的功效，主治心慌心跳、煩熱不安、頭目脹痛、咽喉干痛、尿頻尿急、熱澀疼痛、黃疸、跌打損傷、骨折、風濕熱痹肢體關節紅腫熱痛[1]。相關研究表明，定心藤中含有黃酮、生物堿、強心苷、酚性成分、有機酸、皂苷、鞣質及氨基酸等類別的化學成分[2-5]，但關于定心藤中總黃酮化合物的提取研究報道較少[6-7]。

雙水相提取技術始于20世紀60年代，是利用物質在互不相容的兩相中分配系數的不同來進行提取分離的方法[8]。傳統聚合物與無機鹽形成的雙水相體系因為聚合物粘度較大，導致成本較高、提取物的后續處理比較困難等缺點，最近發展由低級醇如乙醇、丙醇與鹽組成雙水相體系[9-11]，該法具有提取分離條件溫和、過程易于應用于實際生產、生物適應性廣等優點，被廣泛應用于生物提取、天然產物分離、食品化工等行業[12-15]。該研究擬采用超聲耦合乙醇-水-硫酸銨雙水相提取定心藤總黃酮，并通過單因素試驗和正交試驗對提取條件進行優化，為定心藤中總黃酮的提取開發利用提供基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

定心藤新鮮藤莖采自云南省普洱市柏枝寺，經云南農業大學熱帶作物學院馬曉老師鑒定為真品。樣本切片，于60 ℃干燥后粉碎過40目篩，冷藏備用。

1.2試驗試劑

蘆丁標準品，國家標準物質中心；其他試劑均為國藥集團分析純試劑。

1.3主要儀器

FW200萬能粉碎機；上海科導SK5210HP超聲清洗儀；上海精科UV759紫外-可見分光光度計；梅特勒AL204電子分析天平；上海一恒DZF6053真空干燥箱。

1.4試驗方法

1.4.1乙醇-硫酸銨雙水相體系制備。

在一定濃度的硫酸銨溶液中加入無水乙醇，利用硫酸銨的鹽析作用形成雙水相體系，并通過改變乙醇的比例和硫酸銨的濃度控制雙水相體系的組成[16]。

1.4.2標準曲線的繪制。

總黃酮含量的測定采用分光光度法，配制0.2 mg/ml蘆丁為標準溶液，分別取1.00、2.00、300、4.00、5.00、6.00、7.00 ml于25 ml比色管中，加入1 ml 5%NaNO2溶液，搖勻后放置6 min，然后加入1 ml 10%Al（NO3）3溶液，搖勻后放置6 min，再加入6 ml 4%NaOH溶液，用30%乙醇定容至刻度線[16]，搖勻，放置15 min后于510 nm波長處測定吸光度，以吸光度為橫坐標、蘆丁濃度為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程A=12.559x + 0.003 4，相關系數R2=0.999 6。

1.4.3樣品總黃酮的提取。取1 g定心藤干粉于100 ml圓底燒瓶中，按照超聲功率500 W、超聲溫度60 ℃[6]，分別研究不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60）、不同硫酸銨濃度（0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 g/ml）、乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%）、不同超聲時間（10、20、30、40、50、60 min）對定心藤總黃酮提取率的影響。

1.4.4正交試驗設計。

為了對提取工藝進行優化，在上述單因素試驗基礎上，選擇浸提料液比、硫酸銨濃度、乙醇濃度和超聲時間4個因素按照L9（34）設計四因素三水平試驗（表1）。

1.4.5樣品總黃酮的分析。

取1 ml定心藤提取液，于25 ml比色管中，加入1 ml 5%NaNO2溶液，搖勻后放置6 min，然后加入1 ml 10%Al（NO3）3溶液，搖勻后放置6 min，再加入6 ml 4%NaOH溶液，用30%乙醇定容至刻度線[15]，搖勻，放置15 min后于510 nm波長處測定吸光度，利用回歸方程計算樣品中總黃酮含量，并按照下面公式計算總黃酮提取率，即總黃酮得率（%）=（提取液中總黃酮質量/原料質量）×100%。

2結果與分析

2.1單因素影響試驗

2.1.1料液比對提取的影響。

從圖1可以看出，料液比直接影響定心藤總黃酮的得率，料液比過大或過小均不利于總黃酮的提取，料液比過小，溶劑體積過少，黃酮類從樣品中擴散到溶劑中的速率低，且極易達到飽和狀態；料液比過大，不但會在加熱過程中造成能力的浪費，更會因溶劑用量過多、硫酸銨用量增大，影響雙水相的穩定性，從而導致總黃酮的得率下降，因此選用1∶40（m/v）為最佳料液比。

3結論與討論

超聲波可以使細胞壁在超聲空氣化產生的巨大壓力下瞬間破碎，并通過聚能效應、微擾效應和界面效應等提高傳質速率和效果，從而對黃酮類化合物的提取起到很好地輔助效果[17]。在乙醇-硫酸銨雙水相體系中，黃酮類分配于乙醇上相，而其他水溶成分如多糖、氨基酸等分配于鹽水下相，從而很好地實現黃酮類化合物與其他雜質成分的分離，提高黃酮類成分的純度及提取效率。

筆者通過單因素試驗和正交優化試驗設計，將超聲提取與乙醇-硫酸銨雙水相分離技術耦合集成，研究了定心藤中總黃酮的提取最佳工藝，并通過試驗驗證最佳工藝下總黃酮的得率，發現在乙醇濃度80%、硫酸銨濃度0.30 g/ml配制雙水相溶液、料液比1∶50（g/v）、超聲提取時間30 min的條件下，定心藤總黃酮平均得率可達2.02%，該工藝耗時短、提取分離簡單、得率較高，具有很高的實際生產應用價值。

參考文獻

[1] 蔡晨秋，馬瑛，唐麗，等.藥用植物定心藤的研究進展及民族應用概況[J].中央民族大學學報：自然科學版，2011，32（4）：70-73.

[2] 戴斌.中國現代瑤藥[M].南京：廣西科學技術出版社，2009：89-91.

[3] 曾立，尹文清.定心藤中化學成分的研究[J].藥學服務與研究，2010，10（6）：418-421.

[4] 曾立，尹文清.定心藤中酚性成分的研究[J].中華中醫藥雜志，2011，26（4）：838-840.

[5] 陳承聲，陳清光，曾隴梅.定心藤（Mappianthus iodioides）化學成分研究[J].中山大學學報，2000，39（6）：120-122.

[6] 黃瓊，田玉紅，蒲香.定心藤總黃酮的提取及抗氧化活性的研究[J].中成藥，2012，34（11）：2242-2244.

[7] 柯永建，樂仁昌.定心藤中總黃酮的超聲波提取工藝研究[J].海峽藥學，2008，20（10）：65-67.

[8] 陳秀娟，蘇慧英，王光琴，等.雙水相分離純化荷葉中黃酮類化合物[J].廣東化工，2011，38（12）：10-13.

[9] LIU X H，GAO Y T，TANG R S，et al.On the extraction and separation of iodide complex of cadmium（Ⅱ）in propylalcohol ammonium sulfate aqueous biphasic system[J].Sep Puri Tech，2006，50（2）：263-266.

[10] GAO Y T，WANG W.Distribution Behaviors of Pd（Ⅱ）in PrOH-（NH4）SO4 aqueous biphasic system and its application in determination of Pd（Ⅱ）[J].Precious Metals，2006，27（3）：45-49.

[11] 高云濤，吳立生，王偉.丙醇-硫酸銨-水液-液體系萃取分離鉑、鈀、銠和金[J].分析化學，2001，29（8）：901-903.

[12] KARAKATSANIS A，LIAKOPOULOU-KYRIAKIDES M.Comparison of PEG/fractionated dextran and PEG/industrial grade dextran aqueous two-phase systems for the enzymic hydrolysis of starch[J].J Food Eng，2007，80（4）：1213-1217.

[13] PENNA DALLORA N L，DEGAM KLEM J G，PEDRO DE ALCNTARA PESSA FILHO.Partitioning of model proteins in aqueous two-phase systems containing polyethylene glycol and ammonium carbamate[J].Biochem Eng J，2007，34（1）：92-97.

[14] 高云濤，王偉.金（Ⅲ）在聚乙二醇-硫酸銨雙水相體系中的分配行為及萃取機理[J].應用化學，2002，19（6）：578-581.

[15] MOKHTARANI B，KARIMZADEH R，AMINI M H，et al.Partitioning of ciprofloxacin in aqueous two-phase system of poly（ethylene glycol）and sodium sulphate[J].Biochem Eng J，2008，38（2）：241-247.

[16] 李彩霞，高海寧，張喜峰，等.超聲輔助雙水相體系提取國槐葉黃酮[J].天然產物研究與開發，2013，25（10）：1387-1391.

[17] 左光德，郝志云，高云濤.超聲與雙水相體系耦合提取竹葉總黃酮研究[J].安徽農業科學，2010，38（23）：12448-12449.