太湖稻區32個水稻品種DNA指紋圖譜的構建及遺傳多樣性分析

鈕玉偉等

摘要[目的]采用SSR標記構建太湖稻區16個常規粳稻品種和16個雜交水稻品種DNA指紋圖譜并進行遺傳多樣性分析。[方法]以篩選出的12對多態性高、穩定性好且在染色體上分布均勻的引物作為核心引物，構建太湖稻區32個主要栽植水稻品種DNA指紋圖譜，以NTSYS-PCV2.10軟件分析遺傳多樣性。[結果]12對SSR引物在32份材料中共擴增出了47個等位基因，平均每對引物4.7個，變幅2～6個；12對引物的多態性頻率（FP）平均值為0.627，變幅0.266～0.833；以遺傳相似系數0.74為閾值可將供試32個水稻品種分成4類。[結論]太湖稻區32個水稻品種遺傳多樣性相對狹窄。

關鍵詞SSR；遺傳多樣性；指紋圖譜；水稻

中圖分類號S511文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）36-12833-03

Abstract[Objective] The aim of this study was to construct a DNA fingerprinting database of 32 rice cultivars in Taihu lake area， and the genetic diversity was analyzed based on simple sequence repeats（SSR）. [Method] Twelve evenly distributed SSR primer pairs with high polymorphisms and good repeatability were successfully screened to construct the fingerprinting database.[Result] Among the 32 varieties，12 primer pairs had 47 polymorphic locis， and 4.7 polymorphic locis were detected by each SSR primer pair on an average with the range from 2 to 6. Results show that， SSR markers are suitable for using in construction of rice DNA fingerprint with polymorphism differences between the selected varieties. The genetic deversity analyzed by the software of NTSYSpc V2.10 indicated that， 32 rice varieties can be divided into 4 types based on the genetic similarity coefficient of 0.74 threshold. [Conclusion] The genetic diversity of 32 rice cultivars in Taihu lake area is relatively narrow.

Key wordsSSR； Genetic diversity； DNA fingerprint； Rice

隨著現代生物技術的發展，以DNA分子標記為基礎的品種DNA指紋技術也飛速發展，并開始應用于品種鑒定等領域[1-2]。利用DNA指紋圖譜鑒別作物品種具有簡單快捷、重復性好、對品種變異鑒別能力靈敏的優點，可直接反映生物的遺傳物質在DNA分子水平上的差異，甚至可以區分一些基因組中的微小變異[3]。DNA指紋圖譜具有較高的多態性和個體特異性，能夠避免外界的環境干擾，不受生長發育時間的制約，快速、穩定及準確鑒定品種（系），包括表型難以鑒定的品種[4]，為作物育種和種子管理提供極大的便利[5]。

已有學者利用微衛星標記（SSR）進行部分地區水稻品種鑒定、指紋庫構建、遺傳多樣性分析[6-9]。陳躍進等[6]選用55對微衛星標記引物對23個水稻品種進行了親緣關系分析。陳英華等[7]構建了東北地區水稻區試新品種的DNA指紋圖譜，劉煒等[8]用37對SSR引物分析了 72個不同生態類型秈粳稻品種的遺傳多樣性。筆者采用篩選的12對水稻SSR引物，構建了太湖稻區主要栽植的32個水稻品種的DNA 指紋圖譜，以期為太湖稻區水稻品種鑒定、遺傳資源評價及親緣關系分析提供理論依據和技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

32份供試水稻品種為2013年太湖稻區栽植的水稻品種，在常熟市農業科學研究所水稻品種展示區按常規栽培和管理收獲，材料編號、品種名稱來見表1。

1.2DNA提取

按照CTAB法提取水稻基因組DNA。操作流程：①研缽中加入100 mg水稻葉子樣品和700 μl CTAB提取液，充分研磨；②轉移混合液至1.5 ml離心管中，65 ℃水浴30 min，每隔5 min振蕩混勻；③取出離心管，冷卻到室溫后8 000 r/min離心2 min；④取出離心管，上清液轉移至1.5 ml離心管中，加入等體積氯仿混勻，振蕩10 min；⑤12 000 r/min常溫離心10 min；⑥轉移上清液至1.5 ml離心管中，加等體積異丙醇，混勻后靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清液。70%～75%乙醇漂洗沉淀2次，超凈工作臺上吹干；⑦加ddH2O 50 μl，沉淀DNA溶解后冰箱保存備用。

1.3PCR擴增及電泳檢測

20 μl反應液中包括10×PCR buffer、0.1 mmol/L dNTP、1 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L Mg2+、50 ng DNA模版和0.3 μmol/L ESTSSR引物。反應程序為94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物選用60 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，36 W電泳3 h。參考王風格等[9]快速銀染法，稍加修改如下：50%無水乙醇、2.5%冰醋酸組成的固定液固定5 min；雙蒸水快速漂洗1次；0.2%AgNO3溶液染色5 min；1.5%NaOH、0.4%甲醛組成的顯影液顯影；固定液定影。

1.4數據分析

根據SSR擴增產物在電泳凝膠上的相對位置，觀察穩定且易于辨別的差異性條帶，選出具有多態性的引物，記錄并進行統計分析，建立其DNA指紋圖譜。統計每對引物擴增的條帶數，計算多態性頻率（frequency of polymorphism，FP）。用Excel的方法計算物種間相似系數（GS）和遺傳距離指數（D），根據所得遺傳系數矩陣用NTSYS2.1軟件進行統計分析并聚類分析。

2結果與分析

2.1品種DNA指紋庫的建立

對所有品種的帶型進行記錄整理后，將12對SSR 引物產生的47個多態位點依次排序，形成一個SSR 數據矩陣（表2），建立32個水稻區試材料的DNA指紋庫，以區分供試的每個品種。12對引物中RM 1195能鑒別常粳128，RM489能鑒別南粳46、常優1218、常優2號，RM5414能鑒別嘉33，RM253能鑒別常優4號，RM337能鑒別南農大094240、常優1211、常優115，其余引物無法單獨地鑒別某一材料。

3討論

3.1遺傳多樣性分析

根據DNA指紋的差異程度進行遺傳聚類分析，可以掌握品種間的親緣關系和遺傳距離，以幫助分析品種的特性。該研究所分析的32個水稻品種，12個微衛星標記的多態性頻率介于0.266～0.833，平均FP值為0.550。表明所選SSR標記的多態性存在較大差異，部分多態性頻率較小，不利于水稻品種的遺傳多樣性分析和品種鑒定。此外，基于常規水稻品種的標記多態性頻率平均值為0516，低于雜交水稻品種的標記多態性頻率平均值0.612。該研究檢測出的47個等位基因，每個位點的等位基因數目不等，變幅為2～6個，平均4.7，低于相關文獻報道中平均標記5. 5個多態性片段，其原因可能與該研究所用材料及SSR引物數較少，遺傳多樣性相對較低有關，也可能與材料間遺傳距離小、所用親本相近有關。

3.2DNA指紋圖譜數據庫

該研究利用分子標記技術對江蘇太湖稻區32份水稻材料進行了鑒定，聚類分析的結果反映了材料之間在DNA水平上的相似性。供試材料間遺傳相似系數都大于0.58，大多數品種顯示出較近的遺傳距離，遺傳基礎相對狹窄。部分材料可以單對引物的特征帶加以鑒別區分，大部分供試材料必須結合多對引物使用，引物之間依靠彼此所能區分的品種不同，從而組合在一起相互彌補區分開圖譜庫中的全部品種。聚類分析顯示，寧47為常優1216的親本，常糯1號為蘇虞香粳122的親本，親緣關系近，不能把它們區別開。聚類分析中，聚類結果有一定的地域分布特點，不同地區的育成品種往往遺傳差異較大，不容易聚在一起；同一單位的育成品種遺傳差異較小，容易歸為一類，如常農粳5、6號、常優2號和常優4號；另外，同一系列水稻品種的遺傳差異也較小，容易聚在一起，如部分常優系列品種聚為一小類，但也可能歸于其他類群中，這可能是不同品種親本的遺傳差異較大所致。

參考文獻

[1] 王鳳格，趙久然，郭景倫，等.玉米品種純度及真偽鑒定中SSR技術標準實驗體系的建立[J].玉米科學，2003，11（1）：3-6.

[2] 李俊芳，張雪原，孫世賢，等.預試品種的真實性和一致性評價[J].玉米科學，2006，14（6）：38-42.

[3] 王鳳格，趙久然，戴景瑞.玉米品種DNA指紋數據庫構建 的標準化規范[J].分子植物育種，2007，5（1）： 128-132.

[4] 朱衛紅，齊建雙，鐵雙貴.DNA指紋圖譜在玉米雜交種真偽及純度鑒定中的應用[J].河南農業科學，2007（10）：33-36.

[5] 肖小余，王玉平，張建勇.四川省主要雜交稻親本的SSR多態性分析和指紋圖譜的構建與應用[J].水稻科學，2006，20（1）：1-7.

[6] 陳躍進，張桂權，盧永恨.利用徽衛星分子標記法研究水稻親緣關系[1].湖南農業科學，2007，33（3）：258-261.

[7] 陳英華，侯昱銘，李洪宇，等.東北地區水稻區試新品種的 DNA指紋圖譜構建及遺傳多樣性分析[J].種子，2009，28（3）：28-35.

[8] 劉煒，李白超，史延麗，等.利用SSR標記進行粳稻品種的 遺傳多樣性研究[J].西南農業學報，2005， 18（5）： 509-513.

[9] 王風格，趙久然，郭景倫，等.一種改進的玉米SSR標記的PAGE快速銀染檢測新方法[J].農業生物技術學報，2004，12（5）：606-607.