水稻玂sGL12基因反義表達載體的構建

黃丹瑩　葉能輝　莊楚雄

摘要應用聚合酶鏈式反應技術（PCR）擴增水稻OsGL12基因反義片段及基因自身的啟動子，并分別克隆到 pUC19克隆載體上，得到含有OsGL12啟動子+OsGL12反義片段的中間載體。對重組子進行PCR檢測和酶切分析并測序，結果表明，長度分別為417和2 199 bp。將OsGL12啟動子+OsGL12反義片段克隆到植物表達載體pCambia1380多克隆位點，構建了該基因的植物反義表達載體pCamGL12。

關鍵詞水稻；GL12；啟動子；反義表達載體

中圖分類號Q782文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）36-12818-03

AbstractOsGL12 antisense fragment and its promoter were amplified by PCR technique and cloned into the same pUC19 clone vector. The recombinant clones were detected by both PCR technique and restriction enzymes. The OsGL12 antisense fragment and promoter were sequenced. Results showed that the lengths of the both DNA fragments were 417 bp and 2199 bp， respectively. The OsGL12 promoter +OsGL12 antisense fragment from intermediate vector pUC19 was cut off and cloned into the multiple cloning sites of the plant expression vector pCambia1380， which can be used as antisense expression vector pCamGL12 for downregulation of OsGL12 gene.

Key wordsOryza sativa L； GL12； Promoter； Antisense expression vector

角質層是覆蓋在陸生植物暴露于地面部分的一種疏水的屏障，主要作用是防止水份的丟失，避免紫外線輻射，降低塵埃、花粉和污染物的沉積[1]。角質層主要結構是蠟質，GL1是有關植物蠟質生物合成的基因，研究表明，在玉米、擬南芥中該基因突變能引起角質層蠟質組成的相應改變[2]；GL1在水稻基因組中存在11 個基因位點，命名為 OsGL11OsGL111，已克隆了3個OsGL1基因[3]，但對于OsGL1基因家族在水稻中的生物學功能尚有很多不清楚。

反義RNA技術是一種調控基因表達的有效技術，已在植物基因工程研究中得到了廣泛應用。通過互補的反義RNA附加到靶RNA鏈阻斷分子的功能，從復制、轉錄和翻譯水平上控制基因的表達和參與基因表達的調控，削弱相應內源目的基因的表達，即產生所謂“下降性調節”[4]。筆者通過構建反義RNA載體，可用于之后的農桿菌介導轉化水稻，觀測OsGL12基因由于部分表達受到抑制而產生的表型變化，推測研究OsGL12基因的功能，在抗逆角度上對進一步研究和改善水稻的生物學性狀具有重要意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料。粳稻品種中花11（ZH11），在華南農業大學網室內栽培。取水稻葉片為材料經液氮速凍后，于-70 ℃冰箱保存。

1.1.2載體與菌株。pUC19質粒克隆載體、轉化載體pCAMBIA1380、大腸桿菌菌株E.Coli.DH5α，均由華南農業大學遺傳工程實驗室收藏。

1.1.3主要試劑與酶。

Amp、Kan、Xgal、IPTG、CTAB，SIGMA公司；DEPC及MOPS，AMRESCO公司；低熔點瓊脂糖，BIORAD公司；TRIzolTM，Invitrogen公司；TaqDNA聚合酶、限制性內切酶及連接酶，Takara公司；其余試劑均為國產分析純產品。

采用TRIZOL法[5]提取水稻總RNA，反轉錄獲得水稻cDNA，作為OsGL12基因片段的擴增模板。擴增體系按照Takara試劑盒要求進行。

OsGL12基因反向片段PCR擴增反應，參數為94 ℃變性2 min 后，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，5個循環，再進行 94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，28個循環，最后68 ℃延伸10 min。

采用CTAB法[6]抽提水稻基因組DNA，作為啟動子克隆擴增模板。啟動子片斷PCR擴增反應條件：94 ℃變性2 min 后，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，反應5個循環，再進行 94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，反應28個循環，最后68 ℃延伸10 min。

1.2.2克隆載體的構建。

OsGL12基因啟動子PCR產物用凝膠試劑盒純化回收，隨后用EcoRI/KpnI雙酶切之后，在連接酶作用下連接到克隆載體pUC19質粒上。熱激法制備感受態細胞[5]。將連接產物電激轉化E.Coli.DH5α感受態細胞，電激后的菌體培養于1 ml SOC中（200 r/min，37 ℃），1 h后取適量菌液均勻涂布在LB固體培養基（含Amp100 μg/μl）上進行藍白斑篩選[6]。挑取白色單菌落，于LB液體培養基過夜培養，堿裂解法抽提質粒DNA雙酶切檢測，用M13系列通用引物對正確重組子進行測序。用引物FP1和RP1擴增的OsGL12基因反向片段，用KpnI/BamHI雙酶切后組裝到帶有啟動子的pUC19克隆載體的下游，檢測方法同“1.2.1”。

1.2.3OsGL12反義表達載體組裝及克隆。

用EcoR I/BamH I將啟動子+反義片段從pUC19載體上切下，與pCAMBIA 1380多克隆位點相連，組裝成反義表達載體pCamGL12（圖1）。電擊轉化E.Coli.DH5α感受態細胞，經藍白斑篩選，挑取陽性克隆用EcoR I/BamH I雙酶切鑒定，得到重組子。

3討論

3.1克隆載體和表達載體的選擇

pUC19是一種常用的高拷貝克隆載體，含有LacZ基因，重組pUC19的克隆轉化細胞在含有IPTG和XGal的培養基上培養時，可通過藍/白法篩選，判斷載體中有無DNA片段的插入，適于DNA片段的克隆、測序、對外源基因進行表達等。該研究首次采用pUC19為骨架構建中間載體。選用的植物表達載體pCAMBIA1380 質粒是雙元載體，含有潮霉素抗性基因和細菌卡那霉素抗性基因，能分別在細菌和植物中復制，適合在植物中表達。

3.2合適的啟動子選擇

在植物反義表達載體中廣泛應用組成型啟動子，如CaMV35S啟動子、Ubiquitin啟動子等。組成型啟動子控制下外源基因在植物所有部位和所有發育階段都會表達，但外源基因在受體植物內持續、高效表達，不但造成浪費，往往還會導致基因表達的時空特異性改變。目前，特異表達啟動子的研究和應用越來越受到人們的重視，自身的啟動子可以與基因表達保持同步，能在植物中特異性地表達外源基因，提高反義抑制的效率[7]。該研究將克隆自水稻OsGL12基因以相反的方向插入到其特異啟動子下游，目的是使細胞合成特異性的與其目標基因的轉錄物互補的反義RNA，使基因表達受到抑制。

3.3反義片段長度的選擇

反義RNA鏈的長度對抑制基因的效果有很大影響。在植物中，覆蓋整個cDNA的反義RNA能夠有效地抑制基因表達。然而，如果受抑制的基因是與發育有關的重要基因，完全的抑制會致死。反義RNA只要與靶mRNA的一小部分（<100堿基）結合即可達到調節作用，說明反義RNA 在發揮作用時并不要求序列的完全互補。反義片段的長度對抑制基因的效果沒有固定的規則，覆蓋全長或部分正義基因都能夠達到調節作用。該研究只采用約0.4 kb的反義序列，抑制基因表達的效果有待進一步做遺傳轉化試驗。

參考文獻

[1] POSTBEITTENMILLER D.Biochemistry and molecular biology of wax production in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1996，47：405-430.

[2] BIANCHI A，BIANCHI G，AVATO P，et al.Biosynthetic pathways of epicuticular wax of maize as assessed by mutation，light，plant age and inhibitor studies[J].Maydica，1985，30：179-198

[3] ISLAM M A，DU H，NING J，et al.Characterization of Glossy l--homologous genes in rice involved in leaf w ax accumulation and drought resistance[J].Plant Mol Biol，2009，70：443-456

[4] 張學文，羅澤民.擬南芥同源轉換盒基因A21反義RNA基因重組體的構建及轉化[J].湖南師范大學自然科學學報，2001，24（1）：79-81.

[5] MASON H S，LAM D M K，AMTZEN C J.Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants[J].Proc Nail Acad Sci USA，1992，89：11745-11749.

[6] J·薩姆布魯克，D·W·拉塞爾.分子克隆實驗指南[M ].黃培堂，等，譯.3版.北京：科學出版社，2001.

[7] 吳曉梅，樸學成，陳明訓，等.白菜型油菜B rDAD1基因的克隆及其植物反義載體的構建[J].河南農業科學，2010（5）：35-39.