青蒿琥酯抑制增生性瘢痕成纖維細胞Smad3表達的研究

李戰　農曉琳　李佳荃等

[摘要]目的：研究青蒿琥酯（ART）抑制增生性瘢痕成纖維細胞的果蠅抗皮膚生長因子原體3（Smad3）的表達。方法：原代培養人皮膚增生性瘢痕成纖維細胞，以濃度為0，75，150，300，600μmol/L ART分別干預24h。熒光定量RT-PCR法檢測其Smad3 mRNA的表達，Western blot法檢測其Smad3蛋白表達。結果：各濃度ART作用于成纖維細胞后，熒光定量RT-PCR法檢測發現Smad3 mRNA表達下調，與空白對照組比較，差異有統計學差異（P<0.01）。Western blot法檢測發現各干預組Smad3蛋白表達下調，與空白對照組比較，差異均有統計學差異（P<0.01）。結論：ART能下調人皮膚增生性瘢痕成纖維細胞Smad3的mRNA及蛋白水平，通過抑制Smad3的表達從而減少膠原合成可能是ART抑制增生性瘢痕的機制之一。

[關鍵詞]增生性瘢痕；成纖維細胞；青蒿琥酯；Smad3

[中圖分類號]R619+.6 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2014）04-0295-04

皮膚增生性瘢痕是臨床上常見的疾病，常不同程度地影響患者的容貌和功能，治療棘手。在創傷愈合過程中，由多種原因所致的以成纖維細胞為主的細胞成分過度增殖、多種致纖維化因子過度表達、以膠原為主的細胞外基質過度沉積及降解減少，導致增生性瘢痕的形成[1]。

本課題組前期實驗將青蒿琥酯作用于增生性瘢痕成纖維細胞，觀察發現在一定劑量內可以明顯抑制成纖維細胞的增生，并誘導其凋亡[2]；通過兔耳瘢痕模型同樣證實其有明顯的抑制瘢痕增生作用[3]。本研究通過體外培養人皮膚增生性瘢痕成纖維細胞，采用不同濃度的青蒿琥酯干預，檢測其對成纖維細胞Smad3的基因及其蛋白的表達的影響，進一步探討青蒿琥酯對皮膚增生性瘢痕的抑制作用及其可能機制。

1 材料和方法

1.1試劑和儀器：青蒿琥酯（純度99.99%，桂林南藥股份公司），DMEM培養基、胎牛血清（美國Gibco公司），TS-100F型熒光倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司），NanoDrop 2000超微量分光光度（Thermo公司）、Step-one plus型PCR擴增儀（美國ABI公司），RNA提取試劑盒RNAiso Plus、PCR引物、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），鼠抗人Smad3單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）， 鼠抗人β-actin單克隆抗體（上海康成公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本來源：無菌條件下切取4例廣西醫科大學第一附屬醫院燒傷整形外科增生性瘢痕病例標本（經臨床及病理證實），病程3～6月，取材前經患者知情同意。納入標準為近2年內未接受瘢痕治療，無系統疾病者。

1.2.2 原代培養：采用組織塊法原代培養增生性瘢痕成纖維細胞[4]，培養液為含20%胎牛血清DMEM培養基，倒置顯微鏡觀察細胞的形態，按1：3反復傳代純化成纖維細胞，實驗使用第3～5代細胞。

1.2.3 熒光定量RT-PCR法測定Smad3的mRNA表達：按5×105/ml的細胞密度接種于25cm2培養瓶中，培養24h后，換用含藥培養基，干預24h，提取各組細胞總RNA，NanoDrop 2000 測定RNA濃度，按逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄后進行SYBR標記熒光定量PCR。委托TAKARA公司引物設計及合成引物，并于NCBI數據庫進行BLAST驗證，引物序列為：目的基因Smad3上游引物5'-CCAGGGCTTTGA GGCTGTCTA-3'，下游引物5'-GCAAAGGCCCATTCAG GTG-3'（143bp）；選擇GAPDH作為內參，GAPDH 上游引物5'-GCACCGTCAAGGC TGAGAAC-3'，下游引物5'-TGGTG AAGACGCCAGTGGA-3'（138bp）。按試劑盒說明書進行擴增，反應體系為SYBR R Premix Ex TaqTM 10μl，上游引物 0.4μl，下游引物 0.4μl，ROX 0.4μl，去離子水6.8μl，cDNA 2μl，總共20μl；擴增條件為95℃預變性30s→95℃變性5s→60℃退火、延伸30 s，共40個循環。2-△△Ct法表示Smad3的相對表達量。△Ct=Ct（目的基因）-Ct（內參基因），△△Ct=△Ct（干預組）-△Ct（空白對照組）。

1.2.4 Western blot法檢測Smad3的蛋白表達：采用上述不同濃度的青蒿琥酯干預后，冰上裂解細胞，離心收集總蛋白，常規Western blot電泳、轉膜及抗體孵育（一抗稀釋比例為1：500，4℃過夜），ECL化學發光及顯影、定影。Image J軟件分析比較Smad3條帶與內參β-actin條帶灰度值比值。

1.2.5 統計分析：應用SPSS16.0統計軟件進行統計學分析。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多樣本間比較采用完全隨機設計單因素方差分析SNK-q檢驗，取P<0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 增生性瘢痕成纖維細胞原代培養形態學觀察：培養5～7天可見組織塊周圍有細小呈長梭狀貼壁細胞爬出（圖1A），之后梭形細胞增殖迅速，15～20天可長滿25cm2培養瓶（圖1B），經傳代3次后即可獲得呈旋渦狀的較純的成纖維細胞（圖1C）。

2.2 青蒿琥酯對Smad3 mRNA表達的影響：Smad3基因和內參基因GAPDH的各曲線如圖顯示（圖2A，圖2B），擴增曲線的基線平整，指數區明顯，單峰溶解曲線證明擴增產物單一，說明所建立的實時熒光定量PCR方法檢測Smad3具有較好的敏感性和準確性。2-△△Ct法分析發現各干預組Smad3的表達明顯低于空白對照組，差異具有統計學意義（P<0.01）。ART 300μmol/L與ART 600μmol/L組兩兩比較無統計學差異（P>0.05），其余各ART組間兩兩比較差異有統計學意義（P<0.01）（表1）。

2.3 青蒿琥酯對Smad3蛋白的表達的影響：免疫印跡法檢測成纖維細胞Smad3蛋白表達相對灰度值結果顯示，各干預組Smad3蛋白表達明顯下降，與空白對照組比較差異均有統計學意義（P<0.01）。ART 75μmol/L組與ART 150μmol/L組兩兩比較差異無統計學差異（P>0.05），余各ART組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.01）。結果見圖3，表2。

3 討論

皮膚增生性瘢痕是臨床常見的難治性纖維化疾病，其特征為成纖維細胞過度增生和細胞外基質異常堆積。治療增生性性瘢痕常用的措施主要包括：手術切除、冷凍、激光、放療、瘢痕內注射藥物等[1]。中藥對增生性瘢痕的防治有著久遠的歷史，對其機制也有獨特的認識，認為它主要有氣血壅滯、經絡痹阻所致，治療上主要是活血化瘀、軟堅散結為主。在目前缺乏更有效的抗增生性瘢痕藥物的情況下，將相對低毒的中藥應用于預防增生性瘢痕，不失為一種選擇[5]。青蒿琥酯是青蒿素的水溶性衍生物，研究表明，青蒿琥酯可抑制惡性腫瘤細胞的增殖，并促進其凋亡[6]，且對多種纖維化疾病均有抑制作用[7]。

轉化生長因子β1（transformation growth factor-β1，TGF-β1）是目前已知的最強的促增生性瘢痕形成因子[8]。TGF-β1主要通過膜受體經胞內信號分子將信號從細胞漿轉導到細胞核內而發揮作用。Smad蛋白家族是TGF-β受體家族（TGF-βR）的底物，當TGF-β與其胞膜受體形成配體-受體復合物時，可以磷酸化絲氨酸/蘇氨酸相關激酶，激活Smads蛋白向細胞核內發出信號，介導核內靶基因的調節。Smads蛋白分子根據其功能和特征的不同分為受體調節型（Smad1，Smad2，Smad3等）、共同通路型（Smad4）、抑制型（Smad6， Smad7）[9]。作為受體調節型Smads的一員，Smad3在與瘢痕發生發展相關的TGF-β1信號傳導通路中發揮關鍵作用；TGF-β1通過激活Smad3信號通路，促進成纖維細胞的增殖、趨化以及加快胞外基質的沉積，抑制該通路則可以發揮抑制瘢痕的作用[10]。

本實驗采用青蒿琥酯作用于體外培養的增生性瘢痕成纖維細胞，將Smad3作為青蒿琥酯作用于成纖維細胞后的檢測因子，發現Smad3在基因及蛋白水平均隨藥物濃度增加表達降低，并在一定濃度范圍內具有濃度依賴性。因此我們推測，青蒿琥酯可能通過抑制增生性瘢痕組織中Smad3的表達，導致Smad3介導的、由TGF-β1與受體結合產生的信號從細胞質轉導到核內的作用減弱，從而使纖維細胞合成膠原蛋白減少，避免過量纖維組織形成，進而抑制瘢痕增生進程。本研究有助于明確中藥抗瘢痕增生的機制，為開發利用中藥治療增生性瘢痕提供了一定的依據。

[參考文獻]

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[3]農曉琳，陳洪，陳石海，等.青蒿素、青蒿琥酯抗皮膚瘢痕的體外實驗研究[J].廣西醫科大學學報，2009，26（2）：202-5.

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[收稿日期]2013-11-25 [修回日期]2014-01-22

編輯/張惠娟