燒傷后增生性瘢痕患者血清中TGF—β和VEGF的濃度檢測及意義

沈銳　張金明　張鳳剛等

[摘要]目的：探討燒傷后增生性瘢痕患者血清中TGF-β、VEGF濃度變化及意義。方法：選擇2009，8～2011，8我科住院的燒傷后增生性瘢痕患者共74例，根據創面愈合后瘢痕增生時間長短分組，分為4組，選擇12例正常人作為正常對照組，共5組。用酶聯吸附法（ELISA）檢測患者血清中TGF-β、VEGF的濃度，5組之間統計比較分析。結果：瘢痕患者血清中TGF-β、VEGF含量與瘢痕增生時段關系密切，1～3月早期瘢痕組血清中TGF-β、VEGF含量開始增加，隨瘢痕的發展升高，4～6個月瘢痕組血清中TGF-β、VEGF含量達到了高峰。隨著瘢痕成熟，TGF-β、VEGF濃度又逐漸下降。結論：燒傷后增生性患者血清中TGF-β、VEGF的含量可較好地反映增生性瘢痕代謝活躍程度，是增生性瘢痕增生活躍程度敏感的標記物。

[關鍵詞]增生性瘢痕；燒傷后；血清；標記物；TGF-β；VEGF

[中圖分類號]R619+.6 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2014）04-0292-03

增生性瘢痕（Hypertrophic scar， HS）是以膠原纖維等細胞外基質過度生成、沉積為特征的皮膚纖維化疾病 [1]。臨床治療方法多樣，但是缺乏十分有效的治療手段。另外，目前臨床上尚缺乏一種準確、可重復評價瘢痕增生程度的指標，不利于抗瘢痕藥物與方法的療效評價、優化與篩選，也深刻影響著瘢痕治療的進展。

轉化生長因子β（Transforming growth factorβ，TGF-β）與血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前研究得比較透徹的，對瘢痕增生起明顯促進作用的細胞因子，兩因子均可在瘢痕組織局部表達、分泌，其表達的量甚至與瘢痕增生的程度密切相關[2-5]。那么這兩種瘢痕形成促進因子是否能夠分泌入血液，能不能通過檢測燒傷后瘢痕患者血液中TGF-β、VEGF兩因子的濃度來評價瘢痕增生的程度，該實驗在這方面進行了有益的探索。

1 對象和方法

1.1 病例及標本的選擇：選擇2009，8～2011，8期間，我燒傷整形外科住院的燒傷后瘢痕患者74例，分屬于瘢痕增生的不同時期。其中男49例，女25例，最大年齡55歲，最小年齡18歲，平均年齡為（27.9±13.4）歲，所有受試者均無妊娠，無罹患其它結締組織疾病，亦無其它影響檢測結果的局部或全身性疾病，為了減少瘢痕面積對實驗結果的影響，規定瘢痕面積均不得大于體表面積的10%。另選12例健康人群作為正常對照組，所采取的檢測均獲得受試者或其家屬知情同意，經醫院倫理委員會審核通過。74例瘢痕患者根據創面愈合后瘢痕增生的不同時段分組，分為4組： ①1～3月的早期瘢痕組；②4～6月的瘢痕組；③7～12月的瘢痕組：④1年以上的接近成熟期的增生性瘢痕組。與正常對照組一起，共為5組。檢測其血清中TGF-β、VEGF的濃度的水平。

1.2 主要試劑和儀器：試劑盒來自于北京生物技術研究所，其它為常用試劑。采用生物素雙抗夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）對標本血清中TGF-β、VEGF含量進行測定。

1.3 實驗標本的制備：抽取靜脈血2ml，置干燥管，室溫下靜置3h，在3000rpm離心機內離心，離心15min。用移液管移取血清0.5ml，置于離心管，標本放于-70℃超低溫冰箱內保存，待標本收集完成后，對實驗標本統一進行檢測，以避免不同批次實驗試劑和實驗操作人員對實驗結果產生影響。

1.4 用ELISA試劑盒對血清中TGF-β、VEGF的濃度進行檢測：標本解凍。標準品的稀釋。根據待測樣品數量決定所需的板條數。加樣：①空白管對照孔不加樣品、生物素標記的抗TGF-β1抗體以及鏈霉素親和素-HRP，只加顯色劑A&B和終止液，其余操作相同；②標準品孔：加入標準品50μg，鏈霉素親和素-HRP（標準品中已事先整合好生物素抗體，故不加）；③待測樣品孔：加入樣本40μl，然后各加入抗TGF-β1抗體10μl、鏈酶親和素-HRP，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37℃溫育60min。配液、洗滌、顯色、終止按試劑盒要求操作。最后測定：用空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值），根據標準品的濃度以及對應OD值計算出保準曲線的直線方程，再根據樣品的OD值在回歸方程上算出對應的樣品濃度。

1.5 實驗結果統計學分析：實驗結果用SPSS統計軟件13.0進行分析。P<0.05認為差別有統計學意義。

2 結果

與正常對照組比較，創面愈合后1～3月瘢痕組血清中TGF-β、VEGF的濃度已有升高。4～6月瘢痕組達到了最高水平，但隨著增生性瘢痕的逐漸成熟，到瘢痕趨向成熟時（1年以后瘢痕），TGF-β、VEGF的濃度又明顯下降，但仍未恢復到正常水平，見表1。

3 討論

增生性瘢痕形成與皮膚損傷程度相關，可發生在身體任何部位，多見于嚴重燒傷、擦傷、撕脫傷等等[6]。增生性瘢痕形成后，其外在表現實際上處在不斷演進之中，早期瘢痕顏色鮮紅，質地韌，明顯突出于正常皮膚平面，但隨著時間延長，瘢痕逐漸成熟，顏色變淺，質地變軟，表面充血的血管亦不復存在。據此，臨床上可以根據肉眼觀察與簡單的檢查，如根據瘢痕顏色、硬度、厚度、瘢痕攣縮程度及其它伴隨癥狀，如有無痛、癢癥狀等指標就可以評判瘢痕增生程度，方便指導臨床瘢痕的診療工作，也可將這些瘢痕簡單的指標制成量表來規范應用，其中著名的是溫哥華瘢痕量表（Vancouver scar scale， VSS），該方法優點是簡單、易行，缺點是存在著一定主觀性和隨意性，臨床應用上存在一定爭議，臨床上，尋找更為客觀的指標來評價瘢痕增生程度實屬必要[7]。

瘢痕是創傷的過度愈合，瘢痕形成與瘢痕局部細胞因子及其信號轉導途徑的異常活化關系密切[8]。TGF-β直接地通過促進瘢痕組織內成纖維細胞增殖以及合成膠原纖維，而VEGF通過促進瘢痕內部大量的血管增生，為瘢痕增生提供充分的氧氣、營養供應，間接地促進瘢痕膠原合成，兩細胞因子均能明顯地促進瘢痕增生與形成[9]。但是瘢痕促進因子TGF-β、VEGF瘢痕組織表達后能否分泌入血，瘢痕患者血液中TGF-β與VEGF的濃度變化與瘢痕增生時段之間的關系是否密切， TGF-β、VEGF兩因子是否可以作為評價瘢痕增生程度的標記物，國、內外尚未見這方面的報道[7，10]。

實驗結果顯示不同時期的瘢痕組織合成的TGF-β、VEGF能夠入血全身分布，表現為患者血清中TGF-β、VEGF的濃度不同程度的升高，兩因子的濃度變化與瘢痕臨床演進過程基本一致。1～3月早期瘢痕組患者血清中TGF-β、VEGF開始升高，臨床表現為瘢痕開始增生，4～6月瘢痕組患者血清中TGF-β、VEGF的濃度達到了最高水平，這時瘢痕增生最為嚴重。隨著，7～12月瘢痕組患者血清中TGF-β、VEGF的濃度又逐漸下降，以至于1年以后瘢痕組TGF-β、VEGF的濃度趨向于正常（但是不能達到正常水平），臨床表現為瘢痕逐漸趨向成熟。實驗結果表明：燒傷創面愈合后，創面愈合調控因子異常上升，是致使燒傷后增生性瘢痕形成重要原因，同時患者血清中TGF-β、VEGF是評價瘢痕增生的理想標記物。

相對于溫哥華瘢痕量表，增生性瘢痕患者血清中TGF-β、VEGF的濃度變化能夠更準確地評價瘢痕組織膠原代謝情況以及反映患者瘢痕增生情況，可以作為評價燒傷后增生性瘢痕增生程度較為敏感的、客觀的標記物。缺點是需要患者抽血檢查，具有一定的創傷，實驗檢查和結果之間有一定的時間差，同時瘢痕患者血清中TGF-β、VEGF的濃度變化不但與瘢痕時段有關，也與瘢痕面積大小等因素相關，實驗結果準確性可能受到干擾，臨床應用時尚需進一步完善。如兩種方法結合使用，可彌補兩者的各自不足。

瘢痕疙瘩局部切除后復發率極高，有學者提出假說，認為在瘢痕疙瘩在形成以前，有典型的損傷后潛伏（有時原發損傷不明顯而被患者忽略），如果第二次觸發（例如單純的外科切除），則會很快復發，病變常常較前增大。該特點可比作一個免疫反射弧：最初的接觸導致致敏階段、記憶形成和效用機制。瘢痕疙瘩形成的第二階段類似于第二次免疫反應。但是該假說沒能找到答案[11]。有趣的是，在臨床工作中，為嚴重瘢痕患者實行植皮手術時，其遠離瘢痕局部供皮區瘢痕增生往往較明顯，令人困惑。該實驗的結果可能有助于解釋這些假說與現象，我們的推測：瘢痕或瘢痕疙瘩局部組織表達、分泌過量的瘢痕TGF-β、VEGF，并分泌入血全身分布，如果其他部位新添創傷或手術，那么創傷或手術局部組織液體中TGF-β、VEGF的濃度因疊加效應勢必較高，瘢痕增生可能異常明顯。介導瘢痕疙瘩“免疫反應”的不是抗體，而可能是血液中高濃度的瘢痕促進因子TGF-β、VEGF。因此，我們可將身體有增生性瘢痕或瘢痕疙瘩存在看成一種“獲得的”的“瘢痕體質”，可能對身體其他部位再發損傷形成的繼發瘢痕產生不利影響。

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[收稿日期]2013-12-08 [修回日期]2014-01-22

編輯/張惠娟