固相微萃取與氣相色譜—質譜聯用測定肉產品中的克倫特羅

江勇 胡貴祥 朱惠芳

摘 要：建立了固相微萃取與氣相色譜-質譜聯用測定肉中克倫特羅的方法。在一定線性范圍內，本方法相關系數0.9993，回收率96%～104%，檢出限0.48 μg /kg，相對標準偏差7.1%。方法快速、準確，具有良好的實際應用價值。

關鍵詞：固相微萃取；氣質聯用；克倫特羅；肉

Using gas chromatography –mass spectra coupled with solid phase microextraction to

determine clenbuterol in meat

JIANG Yong1， HU Gui-xiang2， ZHU Hui-fang2

（1.School of Life Science， Jiangxi Science and Technology Normal University， Nanchang 330013， China；

2. Nanchang Center for Disease Control and Prevention， Nanchang 330038， China）

Abstract： A method was developed for determination of clenbuterol in meat with gas chromatography –mass spectra coupled with solid phase microextraction. The correlation coefficient was 0.9993， and the recovery were between 96%～104% with relative standard deviations of 7.1%. The detection limits was 0.48 μg /kg. The analytical procedure required simple operation and provided accurate and reliable results. The method could be applied in real works.

Keywords： solid phase microextraction； gas chromatography –mass spectra； clenbuterol； meat

中圖分類號：TS251.1 文獻標志碼：A

克倫特羅（Clenbuterol），俗稱“瘦肉精”[1-2]，具有松弛支氣管平滑肌的作用，常用于治療哮喘，為強效選擇性β2-受體激動劑。克倫特羅能夠改變動物體內的脂肪分布，增加瘦肉率，90年代以來，克倫特羅廣泛應用于飼料添加劑中，引起了大量“瘦肉精”食物中毒事件。如今克倫特羅已被世界上大多數國家在畜牧養殖中禁止使用[3-5]。

檢測肉產品中克倫特羅的方法很多，包括：液相色譜法[6]、液質聯用法[7]、氣質聯用法[8-10]、酶聯免疫法（euzymelinked immunosorbent assay，ELISA）[11]等。酶聯免疫法假陽性較高，只能半定量，一般用于克倫特羅的快速檢驗和大批量樣品的初篩實驗。色譜法尤其是氣質聯用法和液質聯用法，為國家標準規定的確證方法，但它們的樣品前處理過程非常復雜，多采用固相萃取、液液萃取以及分子印跡[12]等技術，采用氣質聯用對克倫特羅進行檢測，還需要對克倫特羅衍生化。這些方法檢測成本高、試劑消耗量大、操作時間長。

1990年，Pawliszyn等[13]提出了集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體的固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）技術，無需溶劑，在水質、土壤、食品檢測中得到了廣泛應用。目前已有利用固相微萃取技術測定尿液及水中克倫特羅的報道。

本實驗以肉產品為研究對象，研究固相微萃取結合氣質聯用檢測肉制品中克倫特羅的方法。該方法為保證定性、定量結果的可靠性，同時采用了穩定性同位素稀釋技術。克倫特羅的萃取和衍生均在固相微萃取纖維頭的表面直接進行，縮短了分析時間，提高了分析的準確性和穩定性。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

克倫特羅標準品、D9-克倫特羅標準品（100 ng/μL） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；N，O-雙-（三甲基硅氧基）三氟乙酰胺（BSTFA） 美國Supelco公司；鹽酸、乙酸鋅、氯化鈉、亞鐵氰化鉀和氫氧化鈉均為分析純。分析用水均為高純水。

1.2 儀器與設備

具有AOC5000自動進樣器的GCMS-QP2010氣質聯用儀 日本島津公司； 85 μm 聚丙烯酸酯萃取頭（PA） 美國Supelco 公司；20mL頂空瓶 美國Alltech公司；磁性蓋（含PTFE/藍色硅膠20mm蓋墊） 德國CNW Technologles Gmbh。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準確稱取10 g樣品，然后加入20 mL 濃度為1 mol/L HCl溶液，同時加入150 μL 質量濃度為1 mg/L的D9-克倫特羅內標液。混合勻漿后，轉移至50 mL容量瓶，用少量HCl溶液清洗2至3次，在容量瓶中加入5 mL 的10.6 % （w/v）的亞鐵氰化鉀溶液和5 mL 21.9 % （w/v）的乙酸鋅溶液，用HCl溶液定容。過濾后，吸取10 mL濾液，加入頂空瓶中，滴加30 %的氫氧化鈉，至溶液出現渾濁，然后又消失為止。繼續加入4.5 g氯化鈉，使溶液過飽和，用純水定容至15 mL。在另一頂空瓶中加入100 μL衍生試劑，鉗緊瓶蓋后與樣品頂空瓶一起放入自動SPME進樣器中。

1.3.2 固相微萃取

選取PA纖維頭，采用頂空方式自動萃取樣品。固相微萃取條件為：振蕩頻率504 r/min，萃取溫度90 ℃，萃取時間100 min。萃取完畢后，纖維頭移至衍生試劑頂空瓶中，在優化條件下衍生。衍生完成后，直接進樣，熱解析6 min。然后重復進行下一個樣品的萃取。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Rtx-5MS石英毛細柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；柱前壓552 KPa；進樣口溫度260 ℃；程序升溫：初溫70 ℃，保持3 min，以18 ℃/min升至200 ℃，以58 ℃/min升至245 ℃，25℃/min升至280 ℃，保持2 min；解析時間6 min，不分流時間3 min；載氣He（純度99.999%）。

1.3.4 質譜條件

監測方式為選擇離子（Selected ion mode，SIM）方式，離子源溫度200 ℃，接口溫度230 ℃，溶劑延遲14 min。克倫特羅衍生物的選擇離子為定量離子m/z86，參考離子m/z187、243、262；內標物D9-克倫特羅衍生物的選擇離子為定量離子m/z95，參考離子m/z196、252、262；以定量離子的峰面積內標法定量。

2結果與分析

2.1 固相微萃取條件

對相關文獻[14]中固相微萃取法檢測克倫特羅的條件進行改進，以適應自動固相微萃取的要求。改進后的條件為：振蕩頻率504 r/min，萃取溫度90 ℃，萃取時間100 min。克倫特羅在堿性水溶液中為中等極性半揮發性化合物，適合采用85 μm PA纖維頭進行固相微萃取。為保證溶液的堿性條件，用氫氧化鈉調整，其最終的pH值約為14。在強堿性條件下，如果采用纖維頭直接萃取方式，會影響纖維頭壽命，因而本實驗采取頂空方式進行萃取，以避免纖維頭表面與強堿溶液的直接接觸。

2.2 衍生條件的選擇及優化

采用氣質聯用法測定克倫特羅，必須對克倫特羅進行衍生。常規衍生反應是將克倫特羅與BSTFA在密閉反應瓶內進行。反應時間長，容易受環境影響，，只要微量水分進入反應瓶，就能引起衍生化反應的失敗。

本實驗利用自動固相微萃取裝置，將SPME纖維頭自動插入充滿BSTFA蒸汽的頂空瓶中直接衍生。這種在線衍生技術的實現，使得BSTFA蒸汽直接和SPME纖維頭表面吸附的克倫特羅接觸。由于氣體擴散速度快，因而衍生反應時間可以大大減少。影響在線衍生的因素有衍生時間、衍生溫度及頂空瓶的振蕩頻率，可以分別進行優化。

將30 μL克倫特羅標準液加入頂空瓶中，同時加入4.5 g氯化鈉，純水定容至15 mL，氫氧化鈉調pH至14。SPME條件為：萃取溫度70 ℃，萃取時間60 min，振蕩頻率500 r/min。SPME結束后，纖維頭自動進入含100 μL BSTFA的頂空瓶中，優化衍生溫度、衍生時間和振蕩頻率對衍生效率的影響。

2.2.1 振蕩頻率對衍生效率的影響

圖1 振蕩頻率對衍生效率的影響。

Fig.1 Effect of Agitation speed on the derivation efficiency.

在衍生時間20 min，衍生溫度70 ℃條件下，考察振蕩頻率對衍生效率的影響。振蕩頻率能夠影響衍生試劑在頂空瓶中的揮發及在纖維頭表面的擴散速度，同時也影響了衍生產物從纖維頭表面擴散到頂空瓶的速度，因而振蕩頻率對衍生效率的影響有一個最佳值。由圖1可知，隨著振蕩頻率的增加，響應值先升高，再降低，響應最高的振蕩頻率為500 r/min。

2.2.2 衍生時間對衍生效率的影響

圖2 衍生時間對衍生效率的影響。

Fig.2 Effect of derivation time on the derivation efficiency.

在衍生溫度為70 ℃，振蕩頻率為500 r/min條件下考察衍生時間對衍生效率的影響。由圖2可知，衍生時間的增加提高了克倫特羅衍生效率。最優衍生時間為20 min。20 min后衍生效率隨著時間的增加雖有提高，但變化很小。

2.2.3 衍生溫度對衍生效率的影響

圖3 衍生溫度對衍生效率的影響。

Fig.3 Effect of derivation temperature on the derivation efficiency.

在振蕩頻率500 r/min、衍生時間20 min的條件下，考察衍生溫度下對衍生效率的影響。由圖3 可知，克倫特羅衍生物在色譜圖上的響應值隨著溫度升高而增大，80 ℃時最高，然后緩慢降低，從85～90 ℃，響應值急劇下降。由此可知衍生溫度對衍生效率影響較大。最優衍生溫度為80 ℃。

綜上可知，最優衍生條件為衍生振蕩頻率500 r/min，衍生溫度80 ℃，衍生時間20 min，。

2.3 線性和最低檢出限

在陰性樣品中準確添加克倫特羅標準溶液，使其最終含量分別為 2.5、12.5、50、75、150、250 μg/kg，按1.3節進行樣品前處理及SPME，并按優化后的條件在線衍生，用氣質聯用儀測定，考察其線性。克倫特羅的含量（y）和克倫特羅與內標峰面積的比值（x）之間線性關系良好，線性方程為y=79.79x―4.15，相關系數r2 = 0.9993，最低檢出限0.48 μg/kg（RSN=3），最小定量檢出限1.59 μg/kg（RSN=10）。

2.4精密度與回收率

按上述條件平行測定6個陽性樣品，相對標準偏差（RSD）為7.1%。

在樣品中添加克倫特羅標準溶液，加標濃度分別為2.5、75、150 μg/ kg，按本文條件每個樣品平行測定3次，所得結果見表1。平均回收率為96%～104%。圖4為加標樣品選擇離子色譜圖，克倫特羅和D9-克倫特羅峰形尖銳、對稱，響應較好。

圖4 加標樣品中克倫特羅衍生物和D9-克倫特羅衍生物的選擇離子色譜圖

Fig.4 Chromatogram of clenbuterol BSTFA derivative and D9-clenbuterol BSTFA derivativselected ions in

spiked samples

3 結 論

本實驗采用自動固相微萃取結合氣質聯用法對肉產品中的克倫特羅進行了檢測，方法快速、準確，檢測時間由國標方法的8 h縮短至2 h，實現了檢測過程的自動化。檢測過程中不需要有機試劑，因而消除了有機試劑對環境的污染，降低了檢測成本，具有很好的實際應用價值。

參考文獻：

[1] REEDS P J， HAY S M， DORWOOD P M， et al. Stimulation of muscle growth by clenbuterol lack of effect on muscle protein Nosynthesls[J]. British Journal of Nutrition， 1986， 56： 249-258.

[2] ROTHWELL N J， STOCK M J. Effect of a selectwe /32-adrenerglc agonlst （clenbuterol） on energy balance and body composition in normal and protein deficient rats[J]. Bioscience Reports， 1987， 7： 933-940.

[3] 戴鏡紅， 高偉文， 陳滿基. 一起鹽酸克倫特羅引起食物中毒的調查與思考[J]. 中國動物檢疫， 2003， 20 （10）： 3.

[4] 肖新李，黃飛平，臧清華. 鹽酸克倫特羅引起食物中毒225例[J]. 廣東醫學， 2002（10）： 1004.

[5] 王立斌， 張永慧， 梁春穗. 鹽酸克倫特羅引起特大食物中毒的調查與思考[J]. 華南預防醫學， 2002， 28（1）： 54-56.

[6] COURTHEYN D， DESAEVER C， VERHE R. High-performance liquid chromatographic determination of clenbuteroland cimaterol using post-column derivatization[J]. Journal of Chromatography： Biomedical Applications， 1991， 564 （2）： 537-549.

[7] PHILIPPE A G， MARIE-CLAUDE S， RICHARD H S. Quantitative analysis of clenbuterol in meat products using liquid chromatography-electrospray ionisation tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B， 1999： 736： 209-219.

[8] RAMOS F， CRISTINO A， CARROLA P， et al. Clenbuterol food poisoning diagnosis by gas chromatography-mass spectrometric serum analysis[J]. Analytica Chimica Acta， 2003， 483： 207-213.

[9] CRISTINO A， RAMOS F， SILVEIRA M I N. Control of the illegal use of clenbuterol in bovine production[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2003， 32： 311-316.

[10] HERN?NDEZ-CARRASQUILLA M. Gas chromatography-mass spectrometry analysis of β2-agonists in bovine retina[J]. Analytica Chimica Acta， 2000， 408： 285-290.

[11] PODESTA A， LUPPI A， BENATTI L， et al. A source of false-negative results in clenbuterol analysis in tissues of veal calves[J]. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods， 1998， 40： 27-32.

[12] KOOTSTRA P R， KUIJPER C J P F， WUBS K L， et al. The analysis of beta-agonists in bovine muscle using molecular imprinted polymers with ion trap LCMS screening[J]. Analytica Chimica Acta， 2005， 529： 75-81.

[13] PAWLISZYN J， ARTHUR C. Solid phase microextraction with thermal desorption using fused silica optical fibers[J]. Analytical Chemistry， 1990， 62： 2145-2148.

[14] ENGELMANN M D， HINZ D， WENCLAWIAK B W. Solid-phase micro extraction （SPME） and headspace derivatization of clenbuterol followed by GC–FID and GC–SIMMS quantification[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2003， 375： 460-464.