擬南芥AtXCD1蛋白的原核表達研究

陳光朗等

摘要[目的]研究擬南芥AtXCD1蛋白的原核表達。[方法]構建XCD1原核表達載體，根據NCBI基因序列設計引物，并以PCR擴增得到大量目的片段XCD1，將XCD1連接到原核表達載體pET32a+，并對重組質粒進行測序鑒定，將重組質粒轉化至大腸桿菌原核表達菌株BL21（DE3），對蛋白表達條件：誘導時間、誘導溫度和IPTG濃度等進行優化。IPTG誘導表達獲得目的蛋白，對蛋白表達條件：誘導時間、誘導溫度和IPTG濃度等進行優化。[結果]XCD1序列全長為1 242 bp，與PCR產物大小一致。蛋白XCD1pET32a+較適表達條件為在30 ℃ 0.1 mmol/L的IPTG誘導1.5 h。[結論]該結果為進一步蛋白純化及酶活測定試驗奠定了基礎。

關鍵詞擬南芥（Arabidopsis thaliama）；AtXCD1；重組載體；原核表達

中圖分類號S188；Q753文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）14-04197-02

Prokaryotic Expression of Arabidopsis AtXCD1 Fusion Proteins

CHEN Guanglang， CAO Shuqing et al（School of Biotechnology and Food Engineering， Hefei University of Technology， Hefei， Anhui 230009）

Abstract[Objective] To study prokaryotic expression of Arabidopsis AtXCD1 protein. [Method] To construct the prokaryotic expression plasmid of XCD1， the XCD1 encoding sequence was proliferated by PCR under the direction of the primers designed according to the sequence obtained from NCBI website. Then the cDNA fragments were cloned into prokaryotic expression vectors pET32a+ and sequenced. In addition， recombinant plasmids were transformed into E.coli. BL21 （DE3） for expression. Expression of AtXCD1 was induced to generate their fusion proteins by IPTG， and the protein expression conditions were optimized， such as time， temperature and IPTG concentration. [Result] The whole length of XCD1 sequence is 1 242 bp， the size is the same as PCR products. The proper expression conditions of protein XCD1pET32a+ is 30 ℃ 0.1mmol/L， IPTG induction for 1.5 h. [Conclusion] The study will lay a foundation for further protein purification and enzyme activity determination.

Key wordsArabidopsis； AtXCD1； Recombinant plasmid； Prokaryotic expression

面對日益嚴重的重金屬污染尤其是土壤污染問題，尋找耐受重金屬的植物修復基因并闡明其功能機制具有重要的理論及實踐意義[1]。鎘（Cd）是最具毒性的重金屬元素之一，其化合物可溶于水，具有很強的生物遷移性，極易被植物吸收并積累[2]，Cd2+被作物富集吸收進入食物鏈，進而引起骨質疏松、貧血、高血壓以及腎損傷等疾病[3]。很多基因都參與重金屬鎘的脫毒途徑，如AtATM3、AtPCR1、AtPDR8和AtGSH1等[4-6]。實驗室對AtXCD1基因的研究發現，當把XCD1基因敲除后，敲除突變體對鎘的脅迫表現為敏感，根長鮮重等生理指標都比野生型低。當利用35S過量表達載體獲得XCD1過量表達株系，過量表達株系對鎘的脅迫表現為耐受，這與敲除突變體的敏感表型相一致。這說明XCD1基因極有可能參與擬南芥對鎘的響應調控。

根據擬南芥數據庫的基因組序列，XCD1（At3g10890）基因編碼一個（1，4）β甘露聚糖內水解酶。β甘露聚糖內水解酶可以將植物體內的甘露聚糖和半纖維素等水解成甘露糖等小分子，甘露糖可能作為信號分子間接調節GSH途徑。為了深入研究XCD1基因參與鎘耐受的機理，筆者構建XCD1pET32a+重組載體并將其轉入原核表達菌株BL21中，探索其合適的表達條件，以期為下一步酶活測定及其他蛋白試驗奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 研究對象。野生型擬南芥（Arabidopsis thaliama），記作為（WildType，WT），由美國擬南芥種質資源庫提供，后由實驗室繁育保存。

1.1.2供試菌株和載體。感受態細胞DH5α、原核表達大腸桿菌菌株BL21和原核表達載體pET32a+，由實驗室繁育保存。

1.1.3主要試劑。RNAiso Plus總RNA抽提試劑盒和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒，均購自Fermentas公司；限制性內切酶BamH I和Xho I、T4 DNA連接酶、Easy Taq和BL21感受態細胞等，均購自北京Transgen公司； TIAN Gel MiDi Purification Kit、TIAN quick MiDi Purification Kit和TIAN prep Mini Plasmid kit，均購自天根公司。

1.2方法

1.2.1擬南芥AtXCD1基因克隆。提取擬南芥總RNA，使用反轉錄試劑盒獲得cDNA。根據TAIR網站提供的XCD1基因的CDS序列，結合載體上的酶切位點，使用Primer Premier 5軟件設計XCD1兩端引物。最終設計獲得的引物和酶切位點如下，FP：N N N ggatc cAT GAA GTG TT TGT GTT TTGTCG（BamHⅠ），RP：NNN ctc gag AATTTTAGTTTTTGATAACT TTCCTT（XhoⅠ）。

1.2.2擴增條件。以cDNA為模板，用PrimeSTAR MAX DNA Polymerase高保真酶擴增，擴增條件：98 ℃預變性5 min，98 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環；72 ℃延伸10 min，25 ℃保存。擴增完成后，制備1%瓊脂糖TAE電泳膠，驗證產物條帶大小是否與目的條帶大小相符[7]，若大小相符，用TIANGel MiDi Purification Kit對擴增的基因產物進行純化。

1.2.3XCD1pET32a+原核表達載體的構建。用LA液體培養基大量擴培含pET32a+載體的大腸桿菌，用TIANprep MiniPlasmid kit提取質粒，并驗證大小是否相符。用BamHⅠ和XhoⅠ對純化好的XCD1基因和pET32a+質粒進行37 ℃雙酶切2 h，對酶切產物進行瓊脂糖切膠回收，回收后基因和質粒按照5∶1的體積比16 ℃連接過夜。熱激轉化并涂板，37 ℃倒置培養過夜，挑取單菌落后加入液體培養基擴培，進行菌落PCR。挑取較亮條帶對應的菌送測序。若測序成功，即獲得重組載體。

1.2.4目的蛋白的誘導表達。將成功轉入重組質粒的原核表達菌先37 ℃擴大培養至OD600≈0.6，加入IPTG，再將培養基轉至30 ℃環境中誘導培養。設置空白質粒作對照，嘗試不同濃度的IPTG誘導量及誘導時間，以確定較適合的誘導條件。取不同處理條件下的原核表達菌1 ml，離心收集沉淀，用PBS洗菌體沉淀2次，加入上樣緩沖液，沸水浴5 min，離心取上清，用20 μl進行SDSPAGE電泳分析。

1.2.5SDSPAGE電泳。組裝好制膠模具，先灌入適量的12%聚丙烯酰胺分離膠，待其凝固后再灌入5%的濃縮膠，放置加樣梳，待濃縮膠凝固，小心取下加樣梳，即制好電泳膠。將電泳膠移至電泳槽，加入電泳緩沖液，并上樣。先以80 V恒壓電泳，待溴酚藍指示劑進入分離膠后將電壓改為120 V恒壓，電泳至溴酚藍指示劑到分離膠底部，停止電泳[8-9]。打開模具，取下電泳膠，置于12 cm玻璃皿中，加入5倍于凝膠體積的0.25%考馬斯亮蘭R250 染色液，在水平搖床上搖動染色3 h。倒出染色液后，在平皿中加入適量甲醇脫色液，于水平染色搖床上緩慢搖動，脫色至背景清晰。拍照記錄試驗結果用于后期分析。

2結果與分析

2.1PCR擴增擬南芥AtXCD1基因以擬南芥總RNA反轉錄的cDNA作為模板，加入設計好的XCD1序列兩端引物及其他試劑，擴增目的片段。電泳結果如圖1所示，XCD1序列全長為1 242 bp，與PCR產物大小一致。同時，提取了pET32a+質粒，電泳檢測證明大小合適。

圖1PCR產物及質粒檢測2.2目的基因與質粒的酶切連接轉化及陽性驗證挑取單菌落進行菌液PCR，結果如圖2所示，2號菌和3號菌為陽性菌，大小與目的條帶一致。

圖2菌落PCR結果2.3目的蛋白的表達條件優化為使目的蛋白在原核菌株中具有較合適的表達條件，分別對誘導時間、誘導溫度及誘導劑濃度進行探索。圖3中ABC綜合分析確定，蛋白表達的影響。

圖3目的蛋白表達條件的優化

3結論與討論

試驗主要介紹了XCD1pET32a+重組載體的構建和其在原核細胞中的誘導表達及合適誘導表達條件的探索等問題，最終確定蛋白XCD1pET32a+在30 ℃ 0.1 mmol/L的IPTG誘導1.5 h為較適表達條件，為下一步酶活測定及蛋白純化等試驗奠定了基礎。隨著一些抗逆基因的鑒定和抗逆機理不斷被深入研究，利用轉基因技術將外源抗逆基因導入植物基因組，在提高植物抗逆性、改良農作物遺傳性狀及培育農作物優良品系等方面具有廣闊的應用前景及經濟價值[10]。

參考文獻

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