白木香愈傷組織與葉片DNA快速提取方法的確定

高志暉等

摘要[目的]確定白木香愈傷組織與葉片DNA的快速提取方法。[方法]用TE、ES1、ES2 3種提取液及相應的方法提取葉片和愈傷組織總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測提取產物，通過普通PCR及熒光定量PCR檢查DNA的可用性，并將PCR產物經克隆測序驗證。[結果]ES1法提取的葉片和愈傷DNA條帶清晰，純度較高；普通PCR和熒光定量PCR可擴增出200和600 bp左右的目的條帶。ES2法提取液電泳不能檢測到DNA條帶，但PCR可擴增出愈傷組織200 bp左右目的條帶。TE法得到的提取液檢測不到DNA條帶且PCR不能得到目的條帶。[結論]ES1提取液及相應的提取方法可用于白木香愈傷和葉片DNA高通量快速提取，為沉香屬植物種質研究和分子研究奠定基礎。

關鍵詞瀕危南藥；白木香[Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg]；DNA快速提取；沉香；葉片；愈傷

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）14-04194-03

Determination of the Qualified Rapid-DNA-Extraction Method from Callus or Leaves of Aquilaria sinensis

GAO Zhihui，WEI Jianhe et al（Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Science，Beijing 100193； Hainan Key Lab of SouthChina Medicine Resource Protection and Development，Hainan Branch of Institute of Medicinal Plant Development of Chinese Academy of Medical Science，Wanning，Hainan 571533）

Abstract[Objective] To determine the rapid DNA extraction method from calli or leaves of Aquilaria sinensis. [Method] We tested three methods （TE，ES1，ES2） used in Arabidopsis and rice for rapid DNA extraction from leaves and calli of A.sinensis. The extracted products were evaluated through agarose gel electrophoresis，PCR and realtime PCR reactions.The amplicons were further confirmed by clone and sequencing.[Result] The extraction method using solution ES1 could successfully isolate total DNA from leaves and calli of A.sinensis in 20 min：agarose gel electrophoresis showed clear binds.The DNA was qualified for PCR amplification of ～200 bp or ～600 bp sequences.The extracted product from calli using solution ES2 can also amplify the ～200 bp sequence，but failed to amplify the ～600 bp sequence.Other methods were failed to extract DNA and amplify any sequences.[Conclusion] The method using ES1 solution is qualified for rapid DNA isolation from A.sinensis for PCR amplification，which will lay a foundation for Aquilaria plants germplasm and molecular research.

Key wordsEndangered southChina medicine； Aquilaria sinensis； DNA rapid extraction； Agarwood； Leaves； Callus

白木香[Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg]又稱土沉香，屬瑞香科沉香屬植物，為我國特有的熱帶及亞熱帶常綠喬木，是我國生產名貴芳香類藥材沉香的唯一植物來源。由于沉香的高價值（目前特級沉香塊國際成交價高達10 000美元/kg）且國際市場需求極大，長期以來白木香遭到掠奪式過度砍伐，其原始林已經基本破壞殆盡。1999年白木香被列為國家2級瀕危保護植物并收載于《中國植物紅皮書》。2000年白木香被世界自然保護聯盟（IUCN）列入《世界自然保護聯盟受威脅植物紅色名錄》[2]。2004年白木香列入了《瀕危野生動植物種國際貿易公約》（CITES，即華盛頓公約）附錄，同時產于東南亞等各國生產沉香的沉香屬所有植物均列入了該公約名錄。沉香主要形成于白木香樹干心材部位。然而，健康的白木香不能形成沉香，只有在受到傷害、病菌侵染等脅迫時才會合成沉香類化學成分，經過長時間積累后形成沉香[3-7]。為保護沉香資源，建立高效、穩定的結香技術體系滿足市場需求，亟需利用現代生物技術和分子生物學研究手段尋找高效結香優良種質，解析清楚沉香誘導結香的分子機制，為建立高效結香技術提供依據和思路。其中DNA提取方法是分子研究的基礎，傳統的植物DNA提取方法如CTAB法[8]、SDS[9]法等雖可獲得的DNA純度較高、產量大，但往往程序繁瑣，用時較長，加上一次提取樣品量有限，不能滿足種質鑒定和轉基因植株等分子鑒定的需求。故而尋找一種快速有效的簡易DNA提取方法十分必要。目前，已有擬南芥、水稻、小麥、番茄、油菜、柑橘、松樹等多種植物開發建立了各自適用的快速DNA提取方法，以用于轉基因檢測以及SSR、ISSR等分子標記擴增[10-15]。筆者考察白木香愈傷組織與葉片DNA的快速提取方法，以期為白木香的進一步開發利用提供依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。白木香葉片，取自中國醫學科學院藥用植物研究所溫室種植的3年生白木香（A.sinensis）。

1.1.2主要儀器。天根電動組織研磨器和Sigma 114高速離心機，購自Sigma公司；Thermo CR3i高速冷凍離心機，購自Thermo公司；BioRad凝膠成像系統、BioRad PowerPac電泳儀、Biometra PCR儀和BioRad IQ5熒光定量PCR儀，均購自BioRad公司。

1.1.3主要試劑。SDS（十二烷基磺酸鈉）、EDTA（乙二胺四乙酸）、Tris、NaCl、KCl和異丙醇，均購自北京化學試劑公司；SYBR Green熒光定量PCR酶、Extaq酶和pMD18TSimple載體，均購自寶生物公司；PCR產物回收試劑盒，購自天根生化公司。

1.1.4供試菌株。大腸桿菌感受態細胞，購自北京全式金公司。

1.2方法

注：泳道1～3為TE、ES1、ES2 3種方法提取白木香愈傷組織DNA進行擴增；泳道4～6為TE、ES1、ES2 3種方法提取白木香葉片DNA進行擴增；泳道7為Marker。

圖2不同方法提取DNA的PCR擴增結果圖2表明，擴增愈傷組織TUA基因183 bp長度的片段，ES1方法和ES2方法均可得到擴增產物。而擴增葉片DNA中的TUA基因，只有ES1方法可得到擴增產物。經克隆和測序分析，這得到的3條片段均為正確條帶。這個結果表明ES1方法可用于提取白木香愈傷組織和葉片的總DNA，該DNA可用于擴增較短片段DNA序列。ES2方法可用于提取白木香愈傷組織總DNA并擴增較短片段DNA序列。雖然ES2法所得的抽提混合物經瓊脂糖電泳并不能檢測到DNA條帶，但由于ES2法包含一步熱浴的步驟，可能通過該步驟可使部分蛋白變性，雖然混合物中仍含有變性蛋白，但部分核酸亦可釋放出來，只是由于變性蛋白堵塞膠孔導致無法辨析目的DNA條帶。但這種方法提出DNA的效果仍然有限，僅適用于提取愈傷組織DNA和小片段擴增。

對于較長片段的擴增效果如圖2，采用所有方法得到的愈傷組織和葉片DNA，只有ES1法提取的DNA可擴增出593 bp長的AsS基因片段，其他方法均無法擴增出目的條帶。條帶的正確性也經過了測序檢驗。表明ES1方法提取的白木香愈傷組織和葉片的總DNA也可用于擴增較長片段DNA序列（600 bp）。PCR結果也顯示用ES1方法提取的愈傷組織DNA擴增效果好于葉片DNA，可能是由于白木香愈傷組織中復雜的化學成分較少，擴增干擾較小。

圖3表明，熒光定量PCR結果與普通PCR結果一致，對于TUA基因片段的擴增，ES1法提取的愈傷與葉片DNA以及ES2方法提取的愈傷DNA可擴增出具有相同的溶解峰的產物。對于AsS基因片段的擴增，ES1法得到的2種組織的DNA可以擴增出具有相同溶解峰的產物。進一步證實了前面的結果。同時也表明，ES1法提取的DNA可用于進行熒光定量PCR試驗。注：A為ES1法提取的愈傷與葉片DNA擴增所得TUA基因片段和ES2法提取的愈傷DNA擴增所得TUA基因片段的溶解曲線；B為ES1法提取的愈傷與葉片DNA擴增所得AsS基因片段的溶解曲線。

圖3不同方法提取DNA的熒光定量PCR的溶解曲線安徽農業科學2014年3結論與討論

試驗通過比較3種植物快速DNA提取方法確定了適用于白木香愈傷組織和葉片的快速DNA提取方法為：取20 mg愈傷組織或葉片，加入ES1提取緩沖液，使用電動組織研磨器研磨，離心取上清，異丙醇沉淀DNA，最后用超純水溶解。該方法可于20 min內提取12份白木香愈傷和葉片DNA（提取份數依離心機轉子情況而定），獲得的DNA可用于分子種質鑒定等分子研究。試驗不但確定了白木香愈傷組織和葉片快速提取DNA的最佳方法，也為沉香屬植物快速提取DNA提供了參考。

參考文獻

[1] ERSOON G A.Growing 'the wood of the gods'：agarwood production in southeast Asia[J].Smallholder Tree Growing for Rural Development and Environmental Services：Lessons from Asia，2008，5：245-262.

[2] OLDFIELD S，LUSTY C，MACKINVEN A.The world list of threatened Tree[M].Combridge，UK：World Conservation Press，1998.

[3] YAGURA T，SHIBAYAMA N，ITO M，et al.Three novel diepoxy tetrahydrochromones from agarwood artificially produced by intentional wounding[J].Tetrahedron Letters，2005，46：4395-4398.

[4] POJANAGAROON S，KAEWRAK C.Mechanical methods to stimulate aloes wood formation in Aquilaria crassna Pierre ex H.Lec.（Kritsana） trees[M].WOCMAP III：Conservation，Cultivation and Sustainable Use of MAPs，2005：161-166.

[5] ITOH T，TABATA Y，WIDJAJA E，et al.Structure and artificial induction of aloe wood[J].IAWA Journal，2002，23：466-467.

[6] 戚樹源，林立東，胡厚才.白木香中色酮類化合物的形成[J].中草藥，2000，31（9）：658-659.

[7] 戚樹源，林立東，葉勤法.沉香中芐基丙酮及其在黃綠墨耳真菌中的生物轉化[J].生物工程學報，1998，14（4）：464-466.

[8] MAGUIRE T，COLLINS G，SEDGLEY M.A modified CTAB DNA extraction procedure for plants belonging to the family proteaceae[J].Plant Mol Biol Rep，1994，12 （2）：106-109.

[9] 楊麗，張俊環，孫浩元，等.基于改良SDS法的杏基因組DNA提取[J].中國農學通報，2008，24（4）：69-71.

[10] 劉鵬，邱曉東，郭智慧，等.小麥幼葉DNA快速提取新方法及SSR-PCR擴增[J].江蘇農業科學，2011，39（4）：36-37.

[11] 許明，程祖鋅，黃志偉，等.一種適于轉基因水稻PCR檢測的微量DNA快速提取法[J].生物技術通報，2010（3）：128-130.

[12] 王偉偉，朱長青，劉小花，等.番茄葉片基因組DNA快速制備技術及其在基于實時熒光定量PCR的轉基因檢測中的應用[J].遺傳，2011，33（9）：1017-1022.

[13] 謝景梅，劉曉蘭，曲存民，等.甘藍型油菜成熟籽粒DNA快速提取方法探討[J].作物雜志，2012（1）：17-21.

[14] 施維屬，潘騰飛，鐘鳳林，等.柑橘基因組DNA快速提取及ISSRPCR擴增體系優化[J].生物技術通報，2009（10）：109-113.

[15] 李義良，趙奮成，張應中，等.適用于微衛星標記的濕地松、加勒比松DNA快速提取法[J].生物技術通報，2010（1）：83-86.

[16] 王蘭，龍云銘，劉耀光.一種用于PCR的植物基因組DNA快速制備方法[J].分子植物育種，2009，7（2）：425-428.

[17] 楊雙，阮燕曄，樊金娟，等.一種簡易的擬南芥幼苗微量DNA提取方法[J].沈陽農業大學學報，2005，36（1）：99-100.

[18] 鄒華文，李翠花，王彩麗，等.擬南芥基因組DNA微量提取方法的改良[J].江蘇農業科學，2011，39（6）：52-53.

[19] GAO Z H，WEI J H，YANG Y，et al.Selection of reference genes for studying stressrelated agarwood formation of Aquilaria sinensis[J].Plant Cell Rep，2012，31（9）：1759-1768.

[20] KUMETA Y，ITO M.Characterization of deltaguaiene synthases from cultured cells of Aquilaria， responsible for the formation of the sesquiterpenes in agarwood[J].Plant Physiol，2010，154（4）：1998-2007.