灰紫香蘑的分離純化及ITS序列鑒定

唐慶明等

摘要[目的]對采自內蒙古根河地區的灰紫香蘑進行組織分離與鑒定。[方法]分別選取菌蓋處、菌褶與菌柄交界處和菌柄處進行組織分離，將分離物進行ITS序列分析，計算遺傳距離，并采用鄰接法構建NJ系統發育樹。[結果]菌褶與菌柄交界處為最佳分離部位，菌絲生長速度快、潔白細密、污染率低；其次，子實體自然風干3 d后再進行分離可有效降低菌絲污染程度；最后分離物經ITS序列測定，系統發育分析證實其為灰紫香蘑。[結論]該方法獲得了灰紫香蘑的純培養菌株，為進一步開發和利用灰紫香蘑提供了科學依據。

關鍵詞灰紫香蘑（Lepista glaucocana）；組織分離；ITS序列鑒定；系統發育分析

中圖分類號S646文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）14-04192-02

Isolation and Identification of Lepista glaucocana by ITS Gene Sequence

TANG Qingming et al （Hulun Buir Forestry Bureau，Hulun Buir，Inner Mongolia 021008）

Abstract [Objective] To isolate，cultivate and accurately identify Lepista glaucocana which was collected from Genhe district in Inner Mongolia. [Method] Different tissues from pileus，stipe，junction of pileus and stipe were isolated，then the isolate was identified by internal transcribed spacer （ITS），the genetic distance was calculated，and a NJ systematic tree was established by the neighborjoining method. [Result] The results showed that junction of pileus and stipe is the best isolation position，which mycelia with fast growth and low pollution； Secondly，it is lower pollution when airdry the fruiting body for 3 days； At last，the isolate was identified as L.glaucocana analyzed by phylogenetic relationship of ITS gene sequences. [Conclusion] The pure strain was obtained which can provide a scientific basis for development and use of L. glaucocana.

Key words Lepista glaucocana； Tissue isolation； ITS sequence； Phylogenetic relationship

灰紫香蘑（Lepista glaucocana）隸屬于真菌門（Enmycophyta）擔子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）香蘑屬（Lepista）[1]。子實體中等稍大、菌蓋淡紫色或丁香紫色，后褪至白色，是一種優良的食用菌。其氣味濃香，色澤宜人，鮮食、干食風味俱佳，是具有很高開發價值的優質野生食用菌資源[2]。目前，灰紫香蘑的報道不多，人工馴化方面還未取得實質性進展，雖有對灰紫香蘑菌絲體分離的研究報道[2-3]，但關于其對得到的菌絲體進行鑒定的研究鮮有報道。為了保護及開發利用該資源，筆者采用組織分離法對灰紫香蘑進行了菌種分離純化及ITS序列鑒定，以期為進一步開發和利用灰紫香蘑提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料以2013年9月采自內蒙古根河地區的灰紫香蘑作為供試菌種，試驗材料應選擇朵型正常、無病蟲害、無破損和生長健壯的灰紫香蘑子實體。

1.2方法

1.2.1培養基的制備。PDA培養基：馬鈴薯200 g（去皮），葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1 000 ml，pH自然。

1.2.2不同組織部位對分離的影響。在超凈工作臺上進行組織分離，將子實體用濃度75%的乙醇擦拭表面2～3遍；用滅過菌的解剖刀沿菌菇縱向劃開小口，用手輕輕掰開；用接種鉤在菌蓋處、菌褶和菌柄交界處及菌柄處鉤取一塊菌肉組織；將其迅速移入預先制備好的PDA平板培養基上，每皿接4塊菌肉組織，設置3組重復，放入25 ℃恒溫培養箱內避光培養，觀察各組織部位的長勢情況。

1.2.3子實體風干程度對分離的影響。分別分離新鮮的子實體和經過自然風干3 d的子實體，各接4塊菌肉組織于PDA平板培養基上，設置3組重復，置于25 ℃恒溫條件下避光培養，觀察并記錄菌絲污染情況。

1.2.4基因組DNA的提取、擴增及鑒定。采用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒（天根）分別對灰紫香蘑的子實體和分離培養得到的菌絲體進行基因組DNA的提取。用消過毒的接種鉤鉤取子實體菌褶內純凈的菌肉，放于研缽中，加入液氮充分研磨。刮取分離菌株培養基上的菌絲體，放于研缽中，加入液氮充分研磨。其余步驟參照說明書。

圖3子實體及其分離菌株的rDNA ITS擴增圖譜圖4NJ法構建系統發育樹2.4系統發育分析在NCBI中，進行BLASTN搜索，得到的同源序列主要是同屬和近緣屬的不同種，其中與Lepista nuda的相似度最高為99%，但在比對結果中未發現灰紫香蘑的ITS序列。下載上述相似物種中有代表性的ITS序列，用Clustal X 2.0軟件進行序列比對，并輔以人工修正。基于來自NCBI中的7個種的ITS序列，以子囊菌亞門的冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）作為外參，連同試驗中的ITS序列共9個序列一起用于系統發育分析。用MEGA 4.0中的鄰接法（NJ）構建系統樹。圖4表明，M2與香蘑屬的Lepista nuda具有較近的系統發育關系，其次是Tricholoma mongolicum和Lepista sordida；與近緣屬的Clitocybe subditopoda、Collybia tuberosa序列差異較大，系統發育關系較遠。

3結論與討論

對于食用菌的人工馴化，首先需要解決食用菌的菌種分離問題。常見的菌種分離方法主要有組織分離法、孢子分離法和基內菌絲分離法3種。其中組織分離法因操作簡單，純化率高在實踐中被廣泛地應用[6]。試驗采用組織分離法對灰紫香蘑子實體不同部位進行的分離試驗結果表明，野生灰紫香蘑可在實驗室條件下成功分離且菌褶和菌柄交界處為最佳分離部位，菌絲不但生長致密潔白、生長速度快，并且子實體自然風干3 d后再進行組織分離，菌絲培養較不易受雜菌污染。

目前菌種鑒定，遺傳多樣性研究主要基于形態學水平、細胞水平、生化水平及分子水平得以開展[7]，其中ITS序列分析法因準確性高，簡便易行而具有很大的實用價值。由于ITS區不加入成熟核糖體，所以ITS片段在進化過程中承受的自然選擇壓力非常小，因此能容忍更多的變異[8]。在絕大多數的真核生物中表現出了極為廣泛的序列多態性，即使是親緣關系非常接近的2個種都能在ITS序列上表現出差異，顯示最近的進化特征[9]。通過對供試子實體與菌絲體ITS區段長度比對，驗證了供試菌絲體就是灰紫香蘑的分離物。把待測真菌ITS區段的DNA擴增出來，并測出其序列，然后與數據庫中的資料進行比對，即可確定供試真菌的分類地位。這種鑒定方法允許少量的序列分析誤差或少量錯配，不僅用于分類鑒定，還可對真菌類群作系統發育分析。借助于ITS序列分析法，構建了系統發育樹，擬從分子水平上揭示野生菌株的遺傳背景，反映種間的遺傳親緣關系，為進一步資源保護、馴化和開發利用等工作奠定基礎。

參考文獻

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