復方犬腸寧膠囊的質量標準研究

王妲妲 陳曉蘭 王瑩 崔瀟婷

摘要 [目的]研究復方犬腸寧膠囊的質量標準。[方法]采用薄層色譜（TLC）法對復方犬腸寧膠囊中的黃連、黃柏、白頭翁、黃芪進行定性鑒別，采用高效液相色譜法測定鹽酸小檗堿的含量，研究復方犬腸寧膠囊的質量標準。[結果]薄層色譜鑒別表明，樣品分離度好，斑點清晰，且陰性對照無干擾；鹽酸小檗堿進樣量在10.92～163.74 μg/ml范圍內與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為Y=39 611X-2387.9（R2=0.999 8），平均加樣回收率為97.60%，相對標準偏差RSD=1.64%（n=6）。[結論]該標準操作簡便，專屬性、穩定性、重復性良好，可用于犬腸寧膠囊的質量檢測方法。

關鍵詞 復方犬腸寧膠囊；薄層色譜法；高效液相色譜法；鹽酸小檗堿；質量標準

中圖分類號 S853.7 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）16-05039-03

復方犬腸寧膠囊由黃連、黃柏、白頭翁、黃芪等十味中藥通過制顆粒填充法制備而成的膠囊制劑。處方中白頭翁性苦寒，歸脾胃大腸經，具有清熱解毒、涼血止痢的作用，黃連和黃柏性苦寒，分別歸脾胃大腸和腎膀胱經，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。通過臨床調查研究結果顯示，復方大腸寧膠囊主治犬濕熱瀉痢型腹瀉或病毒感染引起的胃腸炎等。為有效控制犬腸寧膠囊的質量，筆者對其質量標準進行研究，以建立有效的質量控制方法，為復方白頭翁膠囊的安全用藥奠定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 Waters2695/2996/Empower高效液相色譜系統、METTLER TOLEDO XS105電子天平；白頭翁皂苷B4（批號111766-200601）、黃芪甲苷對照品（批號110781 -200512）、鹽酸小檗堿對照品（批號110713-200609、含量98.1%）和黃連（批號111430）、黃柏（批號111520）對照藥材，均由中國藥品生物制品檢定所提供；復方白頭翁膠囊樣品（江蘇農牧科技職業學院制藥廠，批號091102、091110、091121）、乙腈（HPLC）、硅膠G薄層板（國藥集團化學試劑有限公司）；水，為超純水；其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 薄層色譜（TLC）鑒別。

1.2.1.1 白頭翁的薄層鑒別。取本品內容物2 g，加甲醇20 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取白頭翁皂苷B4對照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗[1]，吸取上述2種溶液各3 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（65∶ 35∶ 10）下層液為展開劑、展開、取出、晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃烘至斑點清晰。

1.2.1.2 黃連、黃柏的薄層鑒別。取本品內容物0.5 g，加甲醇20 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗[1]，吸取上述2種溶液各2 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶ 1∶ 2）為展開劑，展開、取出、晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

1.2.1.3 黃芪的薄層鑒別。取本品內容物10 g，加乙酸乙酯30 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液棄去，濾渣揮干，加甲醇30 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，加水30 ml使溶解，濾過，濾液用水飽和正丁醇提取2次，每次20 ml，合并正丁醇提取液，先用等體積的氨試液振搖洗滌，再用等體積的水振搖洗滌，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對照品加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗[1]，吸取供試品溶液5 μl、對照品溶液2 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（65∶ 35∶ 10）下層溶液為展開劑，展開、取出、晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃烘約10 min，日光下檢視。

1.2.2 鹽酸小檗堿的含量檢測[1-4]。

1.2.2.1 色譜條件與系統適應性試驗。色譜柱為AQ.C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.033 mol/L磷酸二氫鉀溶液（25∶ 75），檢測波長265 nm，流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，進樣量均為10 μl。在此色譜條件下，供試品溶液、對照品溶液、陰性樣品溶液各10 μl進樣測定。

1.2.2.2 供試品溶液及陰性樣品溶液的制備。取本品粉末約0.4 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，加甲醇約20 ml，超聲處理30 min，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。按處方，同法制成不含黃連、黃柏的陰性樣品溶液。

1.2.2.3 線性關系考察。精密稱取在105 ℃干燥5 h的鹽酸小檗堿對照品5.26 mg置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取1.0、2.5、5.0、10.0、15.0 ml置25 ml量瓶中，各加甲醇至刻度，搖勻，制得每1 ml含鹽酸小檗堿10.92、21.83、54.58、109.16、163.74 μg的溶液，在“1.2.2.1”色譜條件下，進樣10 μl測定，以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標，繪制標準曲線，進行回歸分析。

1.2.2.4 精密度試驗。取上述同一對照品溶液10 μl，連續進樣5次，按照“1.2.2.1”色譜條件測定峰面積，考察其日內精密度；取上述同一對照品溶液10 μl連續3 d，測定峰面積，考察其日間精密度。

1.2.2.5 加樣回收率試驗。分別取已知含量的樣品5份，各精密加入一定量的鹽酸小檗堿對照品，按“1.2.2.2”供試品溶液制備方法制備并測定，計算回收率。

1.2.3 樣品測定。精密稱取復方大腸寧膠囊不同批號的樣品各6份，按供試品溶液制備方法制備，在“1.2.2.1” 色譜條件下，進行含量測定。

2 結果與分析

2.1 薄層色譜法鑒定結果

2.1.1 白頭翁的鑒別。由圖1可知，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照溶液則無此相應斑點。

2.1.2 黃連、黃柏的鑒別。由圖2可知，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照溶液則無此相應斑點。

2.1.3 黃芪的鑒別。由圖3可知，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照溶液則無此相應斑點。

2.2 高效液相色譜法測定結果

2.2.1 鹽酸小檗堿的專屬性。從供試品色譜中（圖4）可以看出，鹽酸小檗堿色譜峰可達到基線分離與相鄰峰分離度>2，理論板數應不低于9 598，且陰性樣品溶液不干擾測定。

2.2.2 鹽酸小檗堿的線性范圍。經線性回歸分析（圖5），鹽酸小檗堿的回歸方程為Y=39 611X-2 387.9（R2=0.999 8），說明鹽酸小檗堿在10.92～163.74 μg/ml范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.3 精密度試驗。精密度試驗結果（表1）顯示，同一對照品溶液，連續進樣5次，連續測定3 d，測定峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為0.86%、0.74%、0.84%，表明樣品的精密度、穩定性、重現性良好。

2.2.4 回收率試驗。在已知含量的5份樣品中各精密加入一定量的鹽酸小檗堿對照品，按“1.2.2.2”供試品溶液制備方法制備，通過測定的峰面積，計算出處理后樣品含量，并計算回收率，結果發現5份樣品的平均回收率為97.60%，相對標準偏差（RSD）為1.64%（表2），該結果符合要求。

2.3 樣品測定 通過抽取復方犬腸寧膠囊3個批號（091102、091110、091121）的樣品各6份進行含量測定，結果（表3）發現，3個批號樣品鹽酸小檗堿含量分別為3.94、4.26、3.81，相對標準偏差（RSD）分別為1.12%、1.35%、0.83%，根據以上樣品的測定結果，結合不同產地黃連、黃柏鹽酸小檗堿含量的差異及臨床研究結果的分析，暫定本品每粒含黃連、黃柏以鹽酸小檗堿（C20H18ClNO4）計，不得少于1.2 mg。

3 討論

此處方中白頭翁、黃連和黃柏為君藥，發揮清熱解毒、涼血止痢的功效，經前期研究白頭翁的有效成分白頭翁皂苷B4峰面積太小，達不到定量限的要求，不適于作為本品有效含量的檢測指標，因此選擇以白頭翁皂苷的薄層作為定性指標，黃連和黃柏的有效成分鹽酸小檗堿作為含量指標，能夠比較客觀地評價藥物的可控性、有效性和安全性。

鹽酸小檗堿的含量檢測，筆者曾考察提取方法（超聲、回流、浸漬）、提取時間（30、40、50 min），以回流、聲提取方法提取的鹽酸小檗堿含量較高，但兩者含量相差不大，從操作簡便角度考慮，確定提取方法為超聲提取，提取時間為30 min；另比較提取溶劑鹽酸-甲醇（1∶ 100）和甲醇，兩者含量相差不大，考慮到鹵素離子對色譜柱的傷害，確定提取溶劑為甲醇；曾采用乙腈-0.033 mol/L磷酸二氫鉀溶液（35∶ 65）為流動相，但鹽酸小檗堿峰與相鄰雜質峰未達到基線分離，并有拖尾現象。使用文中流動相，結果達到基線分離，峰形較好。經過精密度考察、穩定性考察等試驗，該方法的準確度和重現性良好，列入本品質量標準正文。

根據以上樣品的測定，以及不同產地黃連、黃柏鹽酸小檗堿含量的差異暫定本品每粒含黃連、黃柏以鹽酸小檗堿（C20H18ClNO4）計，不得少于1.2 mg。

參考文獻

[1] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典（二部）2010年版[S].北京：中國農業出版社，2010：附錄32-34，418，420.

[2] 唐艷梅，葉萌，向麗，等.HPLC測定黃柏中的鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸藥根堿[J].華西藥學雜志，2006，21（3）：265-267.

[3] 汪寒林.HPLC法測定黃連上清片中鹽酸小檗堿的含量[J].安徽醫藥，2005，9（9）：671-672.

[4] 黃海衛. 川黃柏中鹽酸小檗堿的含量測定研究[J].湖南中醫藥導報，2003，9（4）：86-87.安徽農業科學，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（16）：5168-5170，5174

責任編輯 黃小燕 責任校對 況玲玲